小鼠胚胎干細胞藥物代謝酶CYP3a11基因敲除的實驗研究

曾軍，王雪丁，陳宏遠，黃民，杜軍

細胞色素酶 P450 3a（CYP3a）負責許多內源性和異生化合物的氧化代謝，是人體肝臟和小腸最豐富的 CYPs，參與毒素、致癌物質、膽汁酸、類固醇激素以及超過 50%臨床用藥等的初級代謝。CYP3a11 是小鼠肝內微粒體中優勢表達的 CYP3a基因[1]，在功能上與人類的 3a4 相類似，但 CYP3a的藥物代謝譜存在著明顯的種系差異[2]，這給動物藥物實驗的有效性帶來挑戰。利用基因敲除技術構建藥物代謝酶基因缺陷型小鼠和人源化小鼠，可為深入研究藥物代謝酶的功能、藥效學和藥物致癌等提供有效模型[3]。基于此，我們設計并構建了小鼠藥物代謝酶 CYP3a11 基因敲除載體，并對小鼠E14 胚胎干細胞（embryo stem cell，ES cell）的CYP3a11 基因進行了敲除，為進一步制作 CYP3a11基因缺陷型小鼠作準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和 ES 細胞株 質粒 pBluescript II SK+phagemid 為美國 Stratagene 公司產品；pCR2.1-TOPO 為美國 Invitrogen 公司產品；大腸桿菌 DH5α 由本室保存；129 品系小鼠 E14 ES細胞株為中科院上海生化與細胞研究所提供；ES細胞培養及篩選所需要的支持細胞來自其他基因敲除小鼠孕 12.5 d 原代培養的胚胎成纖維細胞（mouse embryo fibroblast，MEF）。

1.1.2 工具酶、試劑盒及其他試劑 所有引物均為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；限制性內切酶、T4DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、Taq酶和 PfuUltra? 酶分別購自美國 Promega、NEB、Stratagene 公司；pfu T/A 克隆試劑盒為上海生物工程公司產品；QIAEX II 凝膠回收試劑盒為德國QIAGEN 公司產品；Ganc 和 G418 sulfate 購自美國 Gibco 公司；α-32P-dCTP 為美國 Amersham 公司產品；標記探針用缺口平移試劑盒是華美生物工程公司產品；1 kb ladder DNA plus 核酸分子量標記購于美國 Invitrogen 公司；Defined 胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；重組小鼠白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）購自美國Millipore 公司；牛蛋白胨、瓊脂糖試劑分別購自美國 Sigma 和 Biorad 公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 載體構建方法 取培養的 E14 ES 細胞株，裂解并提取基因組 DNA。根據 NCBI 公布CYP3a11 序列[GeneID：13112，Locus tag：88609]設計引物如下：

P1：5’ AGCTGGCCTGGATATAACTGTGTATA CCAG 3’，P2：5’ GGGCTAGCTTACCTTTATGAGA GACTTTGT 3’，此對引物的產物為敲除基因的長臂上游（site：1940-5326）3.3 kb 片段，命名為LA-up；

P3：5’ AAGCTAGCCCTTCCTGGTCTATAGA CAAGG 3’，P4：5’ CACTCGAGGCCTGGAAGAT GCTCAATTACT 3’，此對引物的產物為敲除基因的長臂下游（site：5317-9318）4 kb 片段，命名為LA-low；

P5：5’ GGAACCCATATGTGAGAGCGCAGAG AGACT 3’，P6：5’ AACCCGGGACTCAGGGCTAC ACACTGTAAT 3’，此對引物的產物為敲除基因的短臂（site：89-2051）2 kb 片段，命名為SA。

建立如下體系：模板基因組 DNA 0.1 μg，10×PCR buffer 2 μl，dNTP 20 μmol/L，引物 P1 和 P2各 500 nmol/L，PfuUltra? 酶 3 U，補加 dd H2O至 20 μl。PCR 反應條件為：94℃變性 5min，再進行如下循環程序 30 次：94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1min，最后 72℃延伸 8min。將 PCR 產物進行 0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

小鼠 CYP3a11 基因敲除載體的構建策略如圖1 所示。擴增得到的 LA-up 和 LA-low 片段，依次連接到 pCR2.1-TOPO 載體中，將來源于質粒pNEOZTK 中的負篩選標記 tk 基因，插入至LA-low 的下游，擴增后做相應酶切并連接得到包含完整下游同源臂的 LA-tk-pCR2.1-TOPO 載體。將新霉素磷酸轉移酶基因 PGK neo 片段連接到pBluescript II SK+載體的多克隆位點的EcoRI 及BamHI 之間，得到載體 neo-pBluescript II SK+。擴增得到的 SA 片段行ApaI +HindIII 酶切，所得0.65 kb 片段連接至ApaI +HindIII 消化的 neopBluescript II SK+載體中，位置在 PGK neo 基因的上游，得到包含上游同源臂的 SA-neo-pBluescript II SK+載體。NotI +ApaI 消化 SA-neo-pBluescript II SK+載體，獲得ApaI-SA-neo-NotI片段，將其連接至 LA-tk-pCR2.1-TOPO 載體相應的酶切消化的位點，從而獲得具有完整 SA-neo-LA-tk 的 CYP3a11基因敲除載體 pCR-CYP3a11_KO。

圖1 小鼠 CYP3a11 基因敲除載體 pCR-CYP3a11_KO構建策略圖Figure 1 Strategy for the construction of pCR-CYP3a11_KO,the CYP3a11 knock-out vector of mouse

1.2.2 小鼠 E14 ES 細胞的準備和轉染 待培養皿中 MEF 長滿，用 10 μg/ml 絲裂霉素處理 4 h后，接種 E14 ES 細胞在 MEF 上進行培養。至 ES克隆長滿，收集細胞，計數，以 1×107個細胞/ml濃度重懸于電轉緩沖液（20mmol/L 羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.3，137mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，0.7mmol/L Na2HPO4，0.6mmol/L 葡萄糖）0.1mmol/L 2-mercaptoethanol（2-ME），加至電極寬度為4mm 的電擊杯。按每杯 20～30 μg 的量加入提純的線性化的 pCR-CYP3a11_KO 載體（PvuI消化），將電擊杯冰上預冷，并轉移至電穿孔儀電轉，電轉參數為250 V/500 μF，電轉后室溫靜置30min。然后將電轉后的細胞均勻加入含絲裂霉素處理的 MEF 的培養皿中，至 37℃孵箱中培養。

1.2.3 CYP3a11 基因敲除 E14 ES 克隆的初步篩選和單克隆 24～36 h 后，除去電轉染的 E14 ES 細胞培養液，加入含有 500 μg/ml G418 和0.2 μmol/L Ganc 的全培養液進行篩選，每 2～3 天換液 1 次，視情況加減 G418 篩選壓力，4 周后，可見 ES 克隆增殖。6 周后挑取克隆轉移到 24 孔板中進行單克隆培養，維持 100 μg/ml G418 的篩選壓力，并逐漸擴大培養面積，用于凍存及提取DNA 進行鑒定。

1.2.4 CYP3a11 基因敲除 E14 ES 克隆的 PCR檢測 將培養在 24 孔板中的 E14 ES 細胞進行傳代時，取部分細胞（約 2×103～3×103個）用 PBS 洗滌并離心收集，置于 200 μl 裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5mmol/L EDTA，0.2%SDS，0.2mmol/L NaCl，0.1 mg/ml 蛋白酶中，37℃消化 3 h，離心，取 5 μl 上清液進行 PCR擴增。PCR 引物設計如下：

P7：5’ GGATTGTGAAACCATACCCA 3’，P8：5’ AAAGCGCATGCTCCAGACTG 3’，其中 P7 位于 SA 上，P8 位于 PGK neo 基因上游，預期產物為830 bp，PCR 擴增條件：94℃1min，58℃1min，72℃2min，35 個循環。擴增產物用 0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.5 CYP3a11 基因敲除 E14 ES 克隆的Southern blot 檢測 培養細胞基因組 DNA 的提取：將 PCR 檢測為陽性的 E14 ES 克隆進行增殖培養和冷凍保存，當細胞數目達到約 1×107時提取 DNA。基因組 DNA 經電泳分析和光密度測定后，取 30 μg 進行HindIII 酶切，電泳分離后進行 Southern 轉移。

探針的分離和標記：探針為1.6 kb 的 PGK neo。用缺口平移試劑盒進行同位素探針標記。反應體系為50 μl，包括 1 μg 的待標記 PGK neo。Southern 雜交按常規方法進行。

2 結果

2.1 CYP 3a11 基因敲除載體的酶切檢測及線性化

基因敲除載體 pCR-CYP3a11_KO 經過ApaI、BamHI、BglII、EcoRV、NotI 酶切，檢測結果如圖2 所示，所有的片段都與預期大小一致。

圖2 pCR-CYP3a11_KO 的酶切圖譜Figure 2 Restriction enzymic analysis of the pCR-CYP3a11_KO

2.2 CYP 3a11 基因敲除的 E14 ES 細胞的初步篩選和單克隆的分離培養

轉染后經 G418 篩選 2 周后，95%以上的E14 ES 細胞死亡。約 4 周左右可見陽性細胞克隆形成，如圖3 所示。6 周左右挑取克隆，最后分離至 24 孔培養板培養的 E14 ES 單克隆共 97 個。

圖3 G418 篩選 6 周后 E14 ES 細胞形成單克隆Figure 3 Single E14 ES cell colony formed under 6 weeks selection of G418

圖4 5 個 CYP3a11 基因敲除 E14 ES 克隆的 PCR 檢測結果Figure 4 PCR result of five single E14 ES cell colonies with CYP3a11 gene knockouted

2.3 CYP 3a11 基因敲除的 E14 ES 細胞株的 PCR檢測

理論上，針對 P3，P4 的擴增產物將橫跨 SA和 PGK neo 基因，如果 CYP3a11 基因已經被敲除，所得 PCR 產物應為830 bp 的片段。97 個單克隆分批進行 PCR 檢測，其中 5 個單克隆的PCR 檢測條帶比較清晰穩定，產物均為預期大小的片段（圖4）。

2.4 CYP 3a11 基因敲除的 E14 ES 細胞株的Southern 檢測

5 個 PCR 檢測為陽性的 E14 ES 單克隆提取的總 DNA 經HindIII 酶切后將消化產物瓊脂糖凝膠電泳、轉膜及 Southern 雜交。理論上，酶解產物將包括約 9 kb neo-LA 片段（圖1），可被 neo探針特異結合。如圖5 所示，Southern blot 結果表明，這 5 個單克隆中都有 neo 基因的整合。結合PCR 檢測結果可以證明，在這 5 個克隆中CYP3a11 基因在 LA 和 SA 序列處已發生重組，部分序列已被 PGK neo 基因所取代。

圖5 5 個 CYP3a11 敲除 E14 ES 克隆的 Southern 印跡檢測結果，所有 DNA 均用 Hind III 消化Figure 5 Southern blot result of five single E14 ES cell colonies with CYP3a11 gene knockouted, all DNA were digested by Hind III

3 討論

CYP450 酶系被證明與藥物、毒物代謝，轉化及致癌密切相關，但目前對其機制的解析遠未清晰。由于 CYP450 酶系種屬間存在差異，各個酶之間代謝譜出現頻繁的交疊及代償，長期以來基于動物實驗的藥代動力學及藥效學研究結果無法直接推及至人，從而導致了許多新藥研究的擱淺。近年來通過基因操作技術而建立的 CYP450 基因敲除小鼠整體模型，如：mEH[4]、sEH[5]、CYP1a[6]、CYP1b1[7]、CYP1a2[8]、CYP2e1[9]基因敲除小鼠，以及 CYP 1a1/1a2[10]、CYP 2g1[11]、CYP 4b1[12]、CYP7a1[13]、CYP2d6[14]、CYP3a4[15]、PXR-null/SXR轉基因[16]等人源化小鼠等，為解決上述問題提供了便利。

本研究第一部分構建了小鼠 CYP3a11 基因敲除替換型載體 pCR-CYP3a11_KO，為提高中靶率，我們注意了以下幾個方面的問題：⑴運用了長鏈 PCR 的方法。為避免堿基發生突變，我們采用了 Stratagene 公司生產的目前保真度最高的PfuUltra? 酶進行基因敲除載體同源臂的擴增，采用熱啟動以最大限度降低產物背景，將循環次數控制在 30 次。同時對重組片段進行序列分析和酶切鑒定，保證了載體插入同源臂的正確性；⑵選擇 CYP3a11 基因的上游 3 號外顯子為敲除序列。CYP3a11 蛋白全序列共 504 個氨基酸，在基因 3 號外顯子區域插入 PGK neo 基因，可使CYP3a11 基因僅表達上游 95 個氨基酸的短肽。這樣可以保證上游同源臂的正確錨定，又能破壞下游重要結構域的表達；⑶盡量增加同源臂的長度。替換型載體同源重組的發生率與同源臂的總長度呈正相關，pCR-CYP3a11_KO 中同源臂總長度約為8 kb（其中 5’-同源臂 0.65 kb，3’-同源臂 7.3 kb），一方面有利于提高重組效率，另一方面短臂有利于用 PCR 法進行初步的篩選鑒定；⑷在載體中選擇正負篩選雙標記的 neo 和 tk 基因。neo 基因位于長短同源臂之間可以保證載體與基因組間同源重組時 neo 基因能整合到基因組中，而 tk 基因在長臂的外側，這樣可以保證在有效的同源重組發生時tk 基因并不整合至基因組上，防止 tk 表達代謝Ganc 毒殺細胞，從而提高了中靶率。本研究第二步通過電轉染該載體進入 ES 細胞成功篩選獲得了 5 個基因敲除的 E14 ES 細胞陽性克隆，也證明了該基因敲除載體的構建是正確的。但需要指出的是，本研究所得 5 個陽性 E14 ES 細胞克隆仍有可能由于轉染和篩選過程中 tk 基因受損或整合的染色體位置抑制其表達而出現假陽性，因此仍需進一步進行驗證。

總之，本研究得到了 CYP3a11 基因替換型打靶載體 pCR-CYP3a11_KO，并通過電轉染的方法將其轉入 129 系小鼠的 E14 ES 細胞，通過篩選和鑒定獲得了 CYP3a11 基因敲除的 E14 ES 細胞陽性克隆，為下一步構建 CYP3a11-null 小鼠奠定基礎。

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