小口徑全生物化異種移植血管制備方法的實驗研究1)

郭曉亮,王學寧,張順業,高 進,馬曉華

隨著冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting,CABG)等多種血管移植手術在外科中的應用,血管移植材料的研究成為人們關注的重要課題。自體血管是目前臨床上最為常用和較理想的材料,但來源有限,且常因靜脈曲張、畸形、動脈粥樣硬化等原因限制其利用,約有30%的患者缺乏可供移植的自體血管[1]。本研究采用脫細胞及肝素處理的方法在短時間內制備小口徑全生物化血管材料,從而提供一種新的移植血管來源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年犬12只,13.6 kg～18.2 kg,平均體重15.8 kg,雌雄不限,由山西醫科大學法醫學院提供。抑肽酶(Aprotinin)、核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)、脫氧核糖核酸酶(Desoxyribonuclease,DNase)、曲拉通-100(TritonX-100)均購于美國Sigma公司;1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)硫二亞胺鹽酸鹽〔1-ethy-3(3-dimethylaminoporpyl)carbodiimide,EDC〕、DHanks液、EDTA(Ethylenediaminetet raacetic acid)均購于上海生物工程有限公司;普通光學顯微鏡:日本 Nikon公司;S23400N掃描電子顯微鏡:日本Hitachi公司。

1.2 取材 于山西醫科大學法醫學院實驗室取缺血時間＜30 min的犬雙側頸動脈,含抗生素(青霉素鉀1 000 U/mL)的生理鹽水沖洗管腔,再輕柔剝離其外層的疏松結締組織,將所取的血管截成長度為5 cm長作為實驗材料,放入4℃Hanks液中。實驗分3組:新鮮犬頸動脈(A)組、單脫細胞(B)組和肝素結合處理(C)組。

1.3 支架的制備 脫細胞步驟:將選取的新鮮的犬頸動脈20條,放在 pH 值 8.0,含 0.05 mol/L NaCl、0.02%EDTA 和 100 kU/mL抑肽酶的0.05 mol/L T ris-cl中振蕩24 h;放在pH值8.0,含1.5 mol/L NaCl、0.02%EDTA 和100 kU/mL 抑肽酶的0.05 mol/L Tris-cl中振蕩24 h;在 pH 值為7.4的Hanks液中清洗4次后放入含1%TritonX-100、0.02%EDTA和100 kU/mL抑肽酶的0.05 mol/L Tris-cl中振蕩24 h;在pH值為7.4的D-Hanks液中清洗。以上操作都在4℃下進行;放入37℃,pH 值 7.6,含 DNaseⅠ(10 mg/L)、RNase(1 mg/L)、Mg2+(3 mmol/L)、Ca2+(1 mmol/L)的10 mmol/L的 Tris-cl中消化1 h～2 h;4℃,pH值7.4,含1%TritonX-100的Tris-cl液浸泡 24 h;4℃,pH值為7.4的 Hanks液中浸泡48 h。

肝素處理步驟:將脫細胞后的犬頸動脈隨機選取10條,室溫下,蒸餾水漂洗3次,每次10 min。再浸入heparin-EDC液(EDC 1.67 g+肝素鈉0.835 g+0.05 mol/L HCl 200 mL,pH1.5),室溫下,pH值為1.5,振蕩48 h。制備好的兩組支架材料放入 D-Hanks液中密封包裝后,經60Coγ射線25KGy輻照消毒,4℃保存備用。

1.4 組織學觀察 分別取3組的血管標本,經10%中性甲醛中固定,石蠟包埋,切取厚度為5 μ m 的切片,分別進行HE染色和 VG染色。取B、C兩組標本用甲苯胺藍(0.05 mg/mL)染色觀察肝素結合效果和結合程度。

1.5 掃描電鏡觀察 分別取新鮮動脈及脫細胞處理后的血管標本,每組標本分別切取5片厚度為1 mm的切片,經2%戊二醛固定,1%鋨酸緩沖液處理、脫水、冷凍干燥、噴金后掃描電鏡觀察。

1.6 機械性能測定 每組取血管標本各5條。縱行切開3組頸動脈標本,室溫下用HD-10型厚度儀測量血管厚度和寬度,算出原橫截面積(原橫截面積=寬度×厚度),應用材料性能試驗機(型號:INSRON5544,太原理工大學生物力學實驗室)測拉伸負荷(牽拉速度為5 mm/min),計算拉伸強度(拉伸強度=拉伸負荷/原橫截面積)、彈性模量、最大載荷、最大變形量和拉伸率;將同組標本中的2段(長約 2 cm)縱行切開,用 7-0Polypropylene縫線作端-端吻合兩針,邊距 1 mm,針距2 mm,打結固定(至少打7個結以防止滑脫),然后用性能試驗機進行單軸拉伸,直至縫線撕脫或斷裂,記錄最大負荷值,重復6次,以測定血管對縫線的耐受力。

1.7 凝血時間 分別取 B、C兩組標本各 6段(長5 cm)浸入PBS液37 ℃保存,分別于脫細胞后 0、3 d、7 d、14 d、21 d取 1 cm×1 cm小塊,仔細剝去外膜;再切成4個等大的組織塊,置入5 mL的試管中;分別加入2 mL同一只兔耳緣靜脈血,立即加橡膠蓋,搖動,紀錄血凝塊出現時間,若超過 1 h不凝,實驗停止記為(-)。

2 結 果

2.1 形態學觀察 新鮮犬頸動脈彈性好,管腔內膜光滑,全長可達15 cm,口徑約3 mm～4 mm,分支少、易游離。脫細胞后血管大體形態無明顯改變,仍具有良好的彈性、無塌陷。

2.2 組織學觀察 HE染色和VG染色:A組血管壁可見細胞均勻分布,纖維排列致密清晰;B、C兩組血管的細胞成分被完全去除,血管支架的細胞外基質成分保留完好,纖維沒有發生斷裂;與A組相比,B、C兩組支架材料的纖維排列較疏松。VG染色結果顯示,支架材料的內面可清晰顯示完整的內彈性膜結構。甲苯胺藍染色:B組染色陰性;C組管壁全層染色陽性。

2.3 掃描電鏡觀察 A組血管內表面覆蓋著完整的單層內皮細胞。經過脫細胞處理后,內皮細胞層被完全去除,無殘留任何細胞及細胞碎片成分;內表面彈性蛋白完整、規則,為網狀排列,并有規則的孔隙結構;單根纖維無明顯的膨脹或斷裂。

2.4 機械性能測試(見表1)3組的間拉伸強度、最大載荷、最大變形量、拉伸率、縫線耐受力并無統計學意義(P＞0.05),僅B、C兩組的彈性模量小于 A組(P＜0.05)。

表1 3組樣本的機械性能測試(±s)

表1 3組樣本的機械性能測試(±s)

組別 彈性模量(mPa)拉伸強度(mPa)最大變形量(mm)最大載荷(N)拉伸率(%)縫線耐受力(mPa)A 組 28.30±3.67 17.14±1.93 11.25±1.79 10.96±1.53 115.12±14.51 1.38±0.14 B組 23.62±2.561) 16.05±2.26 10.87±1.86 9.69±1.36 107.89±12.65 1.28±0.16 C組 24.28±3.121) 15.80±2.97 11.58±2.19 9.77±2.13 112.91±15.89 1.20±0.22與A組比較,1)P＜0.05

2.5 凝血時間測定(見表2)B組在60 min內均有血栓形成;而C組在60 min內未形成血栓。

表2 兩組樣本凝血時間

3 討 論

隨著血管移植術的發展,血管移植物的供需失衡已成為亟待解決的問題之一。目前臨床上廣泛應用的人工血管由于彈性差、順應性差及易形成血栓等缺點,作為血管移植物,尤其是小口徑血管移植物(＜5 mm),尚不能令人滿意。理想的血管移植材料都應具有如下條件:①血管壁應具有完整外膜、中膜和內膜三層結構;②具有良好的生物相容性;③具有生物學特性和血管的力學特性[2]。經脫細胞制備的血管支架為一種全生物化材料,完全可以滿足這些條件。脫細胞制備的支架材料保持了血管的原有形態和物理性能,并保存了細胞識別的結合位點,可以為細胞的黏附、增殖、分化及功能發揮提供與體內組織發育的細胞外基質(ECM)相似的支架條件[3];且無或極低的免疫排斥反應,構建的血管支架材料也顯示出良好的生物相容性和順應性,通暢率高。

本實驗選用機械性能與人血管相似的犬頸動脈,其全長可達15 cm,直徑約3 mm～4 mm,并且分支少,解剖結構清晰。脫細胞處理方法我們選用脫細胞效果較好的去污劑-酶消化法[4],實驗過程包括含蛋白酶抑制因子的低滲液處理、含Triton X-100、DNase和RNase的高滲液處理。Triton X-10 0是一種非離子型表面活性劑,可以通過其分子上的親水基團溶解部分細胞及內在的蛋白酶,使細胞內的蛋白酶緩慢釋放,從而降低了膠原纖維、彈力纖維的損。Samouillan等[5]研究發現使用Triton X-100和膽鹽處理瓣膜組織不影響膠原和彈力纖維結構的穩定性。EDTA屬于基質金屬蛋白酶抑制劑,它可以抑制蛋白酶的激活,減少了基質結構的破壞和溶解;另外,它還能通過螯合對細胞黏附起重要作用的Ca2+,降低細胞間結合的穩定性,促進脫細胞。脫細胞處理后所制備的血管基質材料主要由膠原纖維、彈性纖維、糖蛋白(GAG)等組成[6],膠原纖維和彈性纖維能夠維持血管的彈性和機械強度,且抗原性低,生物可降解性好;GAG是一種非免疫原性物質,能結合生長因子和細胞因子,對細胞的黏附、遷移、增殖和分化起調節作用[6,7]。這些成分與哺乳動物同源性高,且免疫原性很低,可以避免發生免疫排斥反應。組織學染色和掃描電鏡觀察顯示證實經脫細胞處理后犬頸動脈中的細胞成分被完全去除,保留了完整的細胞外基質成分,管壁的結構沒有斷裂和破壞,并保持了規則的孔徑結構,有利于受體細胞的浸潤長入,從而促進支架材料在體內的重塑過程。

如何使制備好的血管支架在移植后仍能保持通暢、防止血栓的形成,是長期以來困擾人們的問題。有研究表明直接將脫細胞后的血管材料植入異體或異種體內后,由于血管內皮細胞被去除,這樣的血管支架材料易形成血栓,其遠期通暢率很低[8]。肝素具有多種生物活性,抗Xa因子強,抗因子Xa和抗因子Ⅱa比值增加,可以減少并且抑制凝血酶,抗凝作用強而可靠。其抗凝作用早已被應用于許多人工材料(冠狀動脈支架、CPB管道等)的制備中,研究者把肝素結合在這些人工材料的表面,證實肝素可以在局部緩慢持久地釋放從而發揮其抗凝活性,對于其長時間內皮化過程中的抗血栓有重要的作用[9]。

本實驗采用Conklin等[10]報道的EDC交聯法,將肝素分子以共價鍵結合到脫細胞后的血管支架的表面膠原上,進行抗凝修飾,減少膠原蛋白的直接暴露。EDC是一種雙功能的交聯劑,它既可與膠原中的氨基酸殘基交聯,又可以將含有碳酸根的有機材料活化,介導其與交聯后膠原支架中的游離氨基酸殘基的肽鍵結合,從而將有機材料結合到膠原支架上。采用甲苯胺藍染色結果顯示肝素結合于支架材料全層;體外凝血試驗顯示經肝素結合后的支架材料有良好的抗血栓形成的能力。并經機械性能測試結果顯示,脫細胞和經肝素結合的脫細胞血管支架的力學特性與正常的血管相比幾乎沒有明顯的變化。

本實驗證實,利用去污劑-酶消化聯合肝素結合法可以制備犬頸總動脈的血管支架材料。所制備的血管支架材料中完全去除了血管的細胞成分,能夠完整地保留血管的細胞外基質成分,使支架材料具有與正常血管類似的三維空間結構;經脫細胞及肝素結合后的支架材料的形態、內徑沒有明顯的改變,其力學特性與正常的血管相比幾乎沒有明顯的變化;并且經肝素結合的血管支架材料具有良好的抗血栓形成能力,能夠提高遠期的通暢率。因此,本實驗制備血管支架材料的方法可以作為制備小口徑異種移植血管的新方法,能夠為后期的動物移植實驗提供所需的移植材料。

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