L-Arg在心肺聯合移植中對心肺保護作用的實驗研究

梁智星,楊志剛,郭建軍,張 勇,王志斌,李志英

近20年來,心 肺 聯 合 移 植(combined heart-lung transplantation,CHLT)已被證實是治療終末期心肺衰竭的一種有效治療方法。供體在獲取、保存和移植過程中發生的心肺缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是導致移植后早期肺功能障礙甚至移植失敗的主要原因,如何做好供體心肺的獲取和保存,減輕IRI,是當前肺移植和心肺聯合移植研究的熱點之一。本文就L-Arg在防治心肺缺血再灌注損傷的作用及其機制進行了初步的研究,期望為L-Arg的臨床新用途提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年犬 20只,體重(16.2±1.5)kg,雌雄不拘,由山西醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 實驗儀器和試劑 體外循環機:STOKERT-SHILEY循環機,呼吸機:Newport Wave E200 ventilator,血氣分析儀:美國I-STAT,電鏡:JEM-100CX電鏡,恒溫干燥箱:上海躍進儀器廠,L-Arg:上海生物化學工程技術研究所,NO、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所,LPD液、St.thomas液:山西醫科大學第一醫院心臟外科。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組 隨機分為實驗組和對照組,每組各10只,每次實驗使用供體犬和受體犬各1只。每組受體犬體重大于供體犬體重的18%～20%[1]。心肺灌注與保存分別使用4℃的LPD液和St.thomas液。對照組僅用4℃的St.thomas液及LPD液灌注心肺并保存,實驗組于St.thomas液及LPD液中分別加入 L-Arg 500 mg/kg及300 mg/500 mL,所有動物實驗前需要禁食12 h。

1.3.2 異體原位CHLT模型的建立 供體犬:肌注氯胺酮(20 mg/kg)和安定(0.5 mg/kg)麻醉后,固定于手術臺上,氣管插管,呼吸機機控制呼吸,全身肝素(3 mg/kg)化。正中開胸,打開心包,縫主動脈與肺動脈荷包線,置入灌注導管并固定,阻斷升主動脈,經主動脈根部灌注4℃St.thomas液或實驗組含加入 L-Arg的 St.thomas液(20 mL/kg,壓力 100 mmHg),同時經主肺動脈灌注4℃LPD液或實驗組含加入 L-Arg的 LPD液(60 mL/kg～80 mL/kg,壓力 15 cmH2O～20 cmH2O,5 min內灌注完),灌注的同時切開左心耳使灌注液流出,直至灌洗液無色透明,肺呈現白色。中度膨肺(70%～80%),鉗夾氣管,切斷升主動脈、上下腔靜脈、氣管、食管和肺韌帶,整塊切除心肺并修剪。供心肺放入 4℃的 LPD液保存 1.5 h～2 h。

受體犬:麻醉同前,經上下腔靜脈及升主動脈建立體外循環(CPB),切除心肺,移植入供心、肺。開始吻合前,供心灌注4∶1冷血(10℃)高鉀停搏液(20 mL/kg),(實驗組加入 L-Arg 24 mmol/L),分別行氣管、主動脈、右心房吻合,氣管吻合完畢后,灌注4:1冷血(10℃)低鉀停搏液一次(20 mL/kg),(實驗組加入L-Arg 24 mmol/L),開始主動脈吻合時,復溫。復溫完畢后行右心房吻合,右心房后壁吻合結束,開放循環。繼續并行CPB復溫,同時吻合右心房前壁,心臟復跳有力,待循環穩定,鼻咽溫升至 36℃～37℃,停 CPB。

1.4 檢測指標 在CHLT過程中,分別測受體麻醉后、主動脈開放5 min和30 min 3個時間點的靜脈血氣分析。取心肺勻漿組織 4℃離心(3 000 r/min)10 min后,取上清液,應用 NO檢測試劑盒,采用硝酸還原酶法,檢測心肺勻漿組織中的NO的含量,應用MDA檢測試劑盒,采用硫代巴比妥酸法,測定心肺勻漿組織中MDA的含量,按照 SOD檢測試劑盒說明,采用黃嘌呤氧化酶法,測定心肺勻漿組織中SOD的活性。

1.5 肺含水量測定 肺組織用生理鹽水沖洗后,立即稱濕重量,然后在70℃的干燥箱下烘 72 h,稱其干重量,計算肺組織的濕/干重比(W/D)。

1.6 肺組織超微結構的觀察 切取供肺上葉組織(1 mm×1 mm×1 mm)用2.5%戊二醛固定,4℃保存,通過JEM-100CX透射電鏡觀察肺組織超微結構的變化。

1.7 統計學處理 實驗數據采用SPSS12.0統計軟件進行分析,數據以均數±標準差(±s)表示,采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同時間PaO2、PaCO2檢測結果(見表 1)

表1 兩組不同時間PaO2、PaCO2檢測結果(±s)mmHg

表1 兩組不同時間PaO2、PaCO2檢測結果(±s)mmHg

組別 PaO2受體麻醉后 主動脈開放5 min 主動脈開放 30 min實驗組 510.5±18.401) 330.7±48.702) 121.5±9.611)對照組 478.7±21.73 229.1±40.12 106.9±8.83組別 PaCO2受體麻醉后 主動脈開放5 min 主動脈開放 30 min實驗組 23.10±7.12 23.74±4.511) 32.17±5.822)對照組 26.85±7.40 31.52±4.60 45.65±5.70與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 移植心肌組織、肺組織 NO、SOD、MDA的含量(見表2、表3)

表2 兩組移植肺組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

表2 兩組移植肺組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

組別 NO μ mol/L SOD U/(mg?port)MDA nmol/(mg?port)實驗組 7.92±2.07 55.52±7.98 4.31±0.65對照組 2.46±1.27 35.05±6.31 5.43±0.71 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

表3 兩組移植心肌組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

表3 兩組移植心肌組織NO、SOD、M DA的含量比較(±s)

組別 NO μ mol/L SOD U/(mg?port)MDA nmol/(mg?port)實驗組 5.62±1.37 78.65±5.63 6.56±0.87對照組 1.24±0.32 21.38±3.98 7.84±1.13 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

2.3 肺組織的濕/干重比 實驗組為(5.32±0.14),對照組為(6.07±0.32),兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 肺組織電鏡超微結構觀察 對照組肺泡Ⅱ型細胞胞漿大小不等、空泡化,板層小體結構融合、線粒體嵴不清晰、血管內皮細胞壁不完整,肺泡上皮細胞少見。而實驗組肺泡Ⅱ型細胞的板層小體結構清晰,線粒體嵴可見,較多完整血管內皮細胞、肺泡上皮細胞。

3 討 論

隨著各種治療手段的進展,心肺聯合移植已成為一種治療晚期心肺疾病的有效方法。盡管已有許多改進措施,心肺移植術后缺血再灌注損傷仍是導致手術失敗的主要原因之一,也是移植后發生慢性排斥反應的重要危險因素[2]。因此,如何改進心肺保存方法,提高心肺保存質量,延長保存時間,減輕心肺缺血再灌注損傷成為心肺聯合移植基礎和臨床研究的熱點。

L-Arg是NO的生理性前體,其生物學活性大部分是經過一氧化氮合成酶(NOS)作用生成 NO而起作用的[3,4]。NO具有進入血管平滑肌激活鳥苷酸環化酶,使細胞內Ca2+濃度降低,血管平滑肌松弛,抑制纖維蛋白原與血小板結合,減少毛細血管通透性、保持血管內皮的完整性等作用。目前多數學者認為血管內皮細胞是體內合成NO的最主要細胞,移植肺在缺血再灌注這一病理生理過程中受到損傷,病理狀態下肺動脈內皮細胞NOS減少,其產物NO也隨之減少[5]。肺毛細血管內皮細胞的損傷導致的通透性增高是缺血再灌注損傷后的基本病理改變,這種損傷主要表現為肺毛細血管通透性增加,進而導致肺水腫,影響肺組織中的氣體交換。肺組織的濕/干重比在一定程度上可以反映肺功能受損的嚴重程度[6]。肺氣體交換功能障礙被認為是評價肺缺血再灌注損傷程度及其保護效果最敏感的指標。本實驗中實驗組測定移植心肺NO的含量比對照組高,W/D較對照組減輕,實驗組PaO2比對照組高,而PaCO2比對照組低。其病理學研究亦發現實驗組肺泡出血及間質水腫較對照組減輕,表明L-Arg在肺灌注保存液中能減輕肺毛細血管的內皮損傷,減少 CPB中的體液積聚,可減輕移植肺間質水腫[7],減輕肺缺血再灌注損傷。

目前研究表明氧自由基生成過多或清除障礙時會對機體造成損傷。它可引起細胞內毒性反應,如細胞器破壞、細胞膜脂質過氧化、細胞內酶失活,核酸破壞等導致細胞死亡[8]。SOD是機體內重要的抗氧化酶,其活性的高低反映了機體清除氧自由基的能力,而MDA作為判定氧自由基造成細胞膜脂質過氧化損傷的指標之一,反映了機體細胞受自由基攻擊的破壞程度[9]。L-Arg可通過促進NO的產生,減少過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)生成,同時增加細胞內抗氧化物谷胱苷肽的水平,還可直接中和氧自由基,消除氧自由基對心肌及肺組織的損害。本研究實驗組心肺組織SOD含量明顯高于對照組,MDA含量較對照組顯著降低,提示 L-Arg可抑制缺血再灌注自由基產生和脂質過氧化,增強內源性清除氧自由基的能力,從而減輕心肺缺血再灌注損傷。

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