阿托伐他汀對蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的干預作用

唐霍全,仝海波,光俊榮,范益民,劉躍亭,郝解賀

腦血管痙攣(CVS)是蛛網膜下腔出血(SAH)常見的并發癥之一,發病率高達30%～90%,是導致患者傷殘率和病死率居高不下的主要原因之一[1]。近年的研究發現,痙攣血管壁組織的凋亡在血管痙攣形成的機制中有重要的作用[2,3],阿托伐他汀具有保護神經和改善蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的作用[4]。本實驗通過觀察大鼠SAH后早期應用阿托伐他汀對基底動脈的影響,探討其對SAH后CVS的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性SD大鼠30只,體重250 g～300 g,購自山西醫科大學實驗動物中心。隨機分為假手術組(A組)、SAH 組(B組)、阿托代他汀組(C組)。

1.2 藥品與試劑 阿托伐他汀(遼寧輝瑞制藥有限公司,每片20 mg),T UNEL試劑盒(北京中杉金橋公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3 動物模型制作與標本處理[5]動物模型制作:采用枕大池二次注血法制作大鼠SAH-CVS動物模型。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后,大鼠頭部及左側股動脈區備皮,常規消毒;大鼠仰臥位,暴露左側股動脈備用;然后改俯臥位,取枕外隆凸以下約2.0 cm正中直切口,暴露枕骨、環椎及環枕膜,用1 mL注射器針頭刺破環枕膜并稍稍推進到達枕大池;有腦脊液流出后,用1 mL注射器抽取股動脈血0.3 mL,在2 min之內注入枕大池;注血后環枕膜穿刺處填塞明膠海綿一塊,俯臥位頭低30°約30 min,以利血液沉積在腦底血管周圍,縫合頭部及股部切口。48 h后同法抽取右側股動脈血0.3 mL注入枕大池,制成大鼠SAH動物模型。假手術組僅在枕大池內注射生理鹽水(0.3 mL),其余步驟相同。

灌胃:首次注射后1 h開始灌胃,每日1次,連續給7 d。阿托伐他汀組:給予阿托伐他汀20 mg/(kg?d)灌胃[4](溶于2 mL蒸餾水)1次給予。假手術組與SAH組灌喂同阿托伐他汀組相同體積的蒸餾水2 mL,1次給予。標本處理:所有大鼠均于第一次手術后7 d處死。處死前均給予10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥位固定,開胸,用 12號針頭左心室穿刺快速灌入37℃生理鹽水300 mL,待心臟鼓起后在右心房迅速剪開一小口,放出血液,生理鹽水在5min內灌完,再灌入4℃4%的多聚甲醛至少30 min等組織變硬后取出帶完整基底動脈的腦干,然后置于上述灌注液中繼續固定24 h,常規石蠟包埋,切片(4 μ m)。

1.4 管壁厚度和內徑周長的測量 腦干橫斷面石蠟切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學顯微鏡下觀察各組大鼠BA微觀結構的變化,用Image Pro Plus v5.0圖像分析軟件測量BA血管內徑周長和血管壁厚度。

1.5 原位末端標記法(TUNEL)檢測 石蠟組織切片常規脫蠟至水,依次滴加蛋白酶K,TUNEL反應混合液,T UNEL過氧化物酶標抗體(POD),DAB溶液顯色至水,蘇木精復染,脫水,透明,中性樹膠封片。同時做不加TdT酶,其他條件相同的陰性對照。每張切片于250倍光學顯微鏡下觀察3個無重復視野,每只動物觀察3張切片。計算呈棕色的Tunel陽性細胞核和所有細胞核,細胞凋亡率=(陽性細胞核數/所有細胞核數)×100%[6]。

1.6 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件,計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 光鏡下觀察BA微觀結構的變化 假手術組BA血管內皮細胞完整平覆于內彈力纖維環上,平滑肌細胞排列有序呈長梭形環繞血管腔,平滑肌層薄。SAH組可見內皮細胞隨內彈力纖維向血管腔隆起,平滑肌細胞排列雜亂,平滑肌層較厚。阿托代他汀組則介于二者之間。

2.2 顯微鏡觀察并計算BA內徑周長和管壁厚度(見表1)SAH組與阿托伐他汀組的內徑周長較假手術組均減少(P＜0.01),管壁厚度卻較假手術組均增加(P＜0.05或P＜0.01);而SAH組內徑周長減少和管壁厚度增加較阿托伐他汀組更顯著(P＜0.05)。

表1 SD大鼠BA血管壁內徑周長、厚度及細胞凋亡率(±s)

表1 SD大鼠BA血管壁內徑周長、厚度及細胞凋亡率(±s)

組別 n 內徑周長 管壁厚度(μ m)細胞凋亡率(%)假手術組 10 885.71±21.68 11.21±0.98 12.64±1.91 SAH 組 10 594.94±18.382) 16.91±0.562) 6.55±1.212)阿托伐他汀組 10 721.95±24.192)3) 12.09±0.591)3) 3.44±0.742)3)與假手術組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與SAH組比較,3)P＜0.05

2.3 T UNEL法檢測細胞凋亡率(見表1)假手術組BA平滑肌細胞凋亡率較低,SAH組與阿托伐他汀組平滑肌細胞凋亡率較假手術組均增多(P＜0.01),而阿托伐他汀組細胞凋亡率較SAH組更顯著(P＜0.01)。

3 討 論

SAH后CVS的高發生率是多因素共同作用的結果,具體機制尚不完全清楚。陳斌等[7]研究發現,阿托伐他汀具有誘導血管壁平滑肌細胞凋亡的作用,并認為平滑肌細胞的凋亡不足是內膜損傷后導致管腔狹窄的重要因素。SAH發生后,特別是自發性動脈瘤性SAH必然有血管壁的損傷,引起血管壁平滑肌細胞的增殖,一旦血管壁平滑肌細胞的增殖與凋亡不能達到平衡,勢必會造成血管腔的狹窄,從而引發一系列的癥狀。阿托伐他汀可以調節二者的動態平衡,從而達到對受累血管的解痙作用。本實驗應用TUNEL法檢測BA平滑肌細胞的凋亡指數,發現阿托伐他汀組明顯高于SAH組,證明阿托伐他汀可以促進血管壁平滑肌細胞的凋亡。通過測量BA血管壁厚度與內徑周長的變化也可以發現阿托伐他汀組較SAH組有所改善,說明阿托伐他汀對緩解SAH后CVS有一定的作用。Cheng等[4]研究也證實阿托伐他汀具有改善蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的作用。

細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下,受內在遺傳機制控制自動結束生命的過程。細胞凋亡過程中起關鍵作用的 因素主 要有Caspase家族 、Bcl-2家族 、Fas、p53、C-myc、C-fos、C-jun以及線粒體。血管平滑肌細胞內Ca2+的穩定對血管平滑肌功能起著重要的調節作用,并且參與了平滑肌細胞的凋亡過程。尼莫地平通過對Ca2+的調控來影響細胞內Caspase-3與Bcl-2表達,從而調節細胞的凋亡[8]。阿托伐他汀能夠增高血管平滑肌細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-M g2+-ATP酶活性[9],使細胞內Ca2+增加,引起細胞內Caspase-3與Bcl-2表達的變化,進而促進平滑肌細胞的凋亡。SAH后CVS是一個復雜的過程,是多種因素共同作用的結果,所以阿托伐他汀通過調節血管壁平滑肌細胞內Ca2+的變化來誘導平滑肌細胞的凋亡對緩解CVS具有一定的局限性。本實驗結果顯示假手術組與阿托伐他汀組血管壁厚度和內徑周長差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。說明阿托伐他汀對緩解SAH后CVS雖有一定的作用,但并不能完全解除受累血管的痙攣狀態,因此在臨床中應該與其他藥物聯合應用。

此外,SAH后CVS的發生與血管內皮細胞產生的內皮衍生舒張因子和內皮衍生收縮因子的動態平衡有密切關系,NO是一種作用極強的血管舒張因子,可以對抗內皮素(ET)的縮血管作用,從而緩解CVS。據研究顯示阿托伐他汀有增加一氧化氮的生物活性,對緩解SAH后CVS起到一定的作用[10]。本實驗沒有對阿托伐他汀的這一作用進行驗證,可能與其對BA平滑肌細胞凋亡的調節共同起作用來綬解SAH后引發的CVS。

總之,阿托伐他汀通過上述途徑來調節SAH后CVS,阿托伐他汀調節CVS的作用可能還有其他途徑,尚需進一步研究。

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