NaCl脅迫對芨芨草苗期脯氨酸代謝的影響

董秋麗，夏方山，董寬虎

（山西農業大學動物科技學院，山西 太谷030801）

土壤鹽漬化是人類面臨的世界性問題，全球約有100多個國家存在不同類型鹽堿地，占陸地面積的10%左右［1］，其引起的滲透脅迫已對植物的生長和產量造成了很大的影響。在滲透脅迫下，植物能否保持正常生長狀況，關鍵在于能否維持體內的水分平衡，而這正是通過積累一定量的溶質，降低植物體內的水勢實現的［2］。脯氨酸是公認的在細胞中起著無毒滲透保護作用的細胞相溶性物質，它被廣泛的積累在各器官中，Pro的積累受多種因素的調控，如：它自身的合成、分解，用于蛋白質的合成及在不同器官中的運輸［3］。植物的Pro合成、累積及代謝是一個受非生物脅迫和細胞內Pro濃度調控的生理生化過程［4，5］。已證明植物體內存在2條Pro合成途徑，根據起始氨基酸命名為Glu途徑和Orn途徑，P5CS和δ－OAT分別是這2個途徑的關鍵酶。支立峰等［6］用飛蛾豆（Vignaaconitifolia）中的P5CS基因轉化水稻（Oryzaglaberrima），再用250 mmol／L NaCl脅迫處理后，轉基因細胞的Pro含量提高，同時轉基因細胞的耐鹽性比野生型增強。陳吉寶等［7］發現脅迫下普通菜豆幼苗葉和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2的轉錄水平快速上升，隨著脅迫時間的延長，轉錄水平逐漸下降；在逆境脅迫下，幼苗葉和根中Pro大量積累，高峰出現在Pv P5CS2基因表達高峰之后。徐春波等［8］將P5CS去除反饋抑制的突變型P5CS－F129A基因轉入冰草（Agropyron）導致植物體中Pro含量成倍增加。這些結果均說明，PvP5CS2基因的表達受干旱、高鹽和冷脅迫誘導，Pro積累受PvP5CS2基因轉錄水平的調控。Roosens等［9］發現轉δ－OAT基因煙草合成的Pro在無脅迫時比對照高3倍，且組成型超表達δ－OAT基因并沒有影響植物在正常條件下的生長；在0.2 mol／L NaCl或等滲的甘露醇脅迫下，轉基因株系積累的Pro比對照高1.5倍，而且有更高的生物量和萌發率。有研究表明，不同植物、不同組織、不同生理條件下2條途徑對Pro積累的貢獻大小存在差異［10］。Pro合成過程中究竟是哪一條途徑居于主導地位，還有待進一步研究。

芨芨草（Achnatherumsplendens）屬禾本科芨芨草屬旱中生多年草本植物，也是一種泌鹽植物，具有很強的抗鹽堿性［11，12］。目前，對于芨芨草耐鹽性的研究很少［12，13］，多見于種植芨芨草生態經濟效益方面的研究。而通過生物措施進行鹽堿地改良是經濟長久的方法，牧草在鹽堿地改良利用中具有重要作用和利用前景［14］。因此，研究芨芨草鹽脅迫下的生理變化及耐鹽性機理，對于改良鹽堿草地具有重要的實踐意義。對其苗期鹽脅迫下Pro代謝途徑進行研究，明確在鹽脅迫下芨芨草的Pro代謝途徑及在不同器官中的運輸，以期為鹽堿地植被恢復與改良提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試草種及來源

試驗用芨芨草種子于2008年10月13日采自山西省偏關縣天峰坪鎮梨園村的農田地埂，海拔1 018 m，111°22′19.1″E，39°27′56.8″N。

1.2 試驗方法

本試驗在山西農業大學草業科學系日光能溫室進行。將種子（100粒／盆）播種于蛭石與珍珠巖體積比為1∶1的塑料盆中（直徑25 cm、高20 cm），插入PVC管以便澆水及營養液，置于晝夜溫度為25／17℃，相對濕度為65%～80%的溫室條件下進行培養。出苗后，每隔2 d用Hoagland營養液澆灌1次，處理于17：00－20：00時進行。其余時間用蒸餾水補充失水，以稱重法確定失水量，當苗齡達2～3周時每盆定苗60株。當出苗7周后對其進行鹽分脅迫，以0（CK），100，200，300，400和500 mmol／L NaCl 6個濃度的營養液為處理液，隔天按100 mmol／L梯度進行遞增，直至達到指定濃度，對照只灌完全營養液，3次重復，采用隨機區組設計。每組鹽脅迫1周后，分別采集其葉片和根系，置于－80℃冰箱保存，進行相關指標的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 Pro含量的測定 按照Bates等［15］的方法。

1.3.2 P5CS的測定 P5CS的抽提方法按照Kavi Kishor等［16］的方法進行。蛋白含量以牛血清蛋白為標準蛋白質，按照Bradford［17］的方法。P5CS活性測定按照 Garcia－Rios等［18］的方法進行。

1.3.3 δ－OAT活性的測定 粗酶提取按照Roosens等［19］的方法進行，蛋白含量以牛血清蛋白為標準蛋白質，參照Bradford［17］的方法。

δ－OAT活性的測定參照Kim等［20］的方法，略做改動。反應體系為：50 mmol／L的磷酸緩沖液、35 mmol／L L－鳥氨酸、5 mmol／Lα－酮戊二酸和0.05 mmol／L磷酸吡哆醛混合，總體積為0.9 m L，再加入0.1 m L酶液，在25℃條件下反應20 min后加入0.3 m L 3 mol／L的高氯酸終止反應，然后加入0.2 m L 2%茚三酮沸水中加熱20 min染色，冷卻后10 000 r／min離心棄去上清液；用1.5 m L無水乙醇溶解紅色沉淀物，離心后取上清液510 nm測定吸光值。產物吡咯啉－5－羧酸（P5C）與茚三酮生成的紅色物質摩爾消光系數為16.5 L／（mmol·cm）。以每min生成0.001 mmol P5C的量為1個δ－OAT活性單位（U）。

1.3.4 ProDH的測定 參照Lutts等［21］方法提取，略做改動。樣品加4倍體積提取緩沖液（w／v）于冰浴中研磨，提取緩沖液為0.1 mol／L Na2HPO4－KH2PO4（p H 7.8），內含1 mmol／L EDTA，10 mmol／L巰基乙醇。勻漿液經3層紗布過濾后3 898 r／min離心15 min。上清液加Triton X－100至終濃度0.15%，渦懸后于冰浴中放置30 min，后于19 491 r／min離心20 min，上清液測酶活性。

活性測定反應混合液體積為2.5 m L，內含0.15 mol／L Na2CO3－Na HCO3（p H 10.3）緩沖液1.6 m L，0.2 m L 0.1 mol／L L－Pro，0.2 m L 0.9 mmol／L 2，6－二氯酚靛酚。30℃水浴中保溫5 min，加入0.5 m L（0.8 mg蛋白／m L）酶提取液，混合均勻后加入0.2 m L吩嗪硫酸甲酯試劑PMS（9 mg／m L，現配），搖勻后立即于600 nm下檢測光密度變化。以每min A600減少0.001為1個ProDH酶活單位（U）。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2003及SAS 8.0統計軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對芨芨草Pro含量的影響

隨著NaCl濃度的增加，芨芨草植株根系與葉片中Pro的含量均呈上升趨勢（表1），且均顯著高于對照（P＜0.05）；在同一濃度脅迫下，芨芨草葉片中Pro的含量均顯著高于根系（P＜0.05），為根系的1.93～7.92倍；當NaCl濃度為500 mmol／L時，芨芨草植株根系與葉片中Pro含量均達到最大值，為303.36和585.77μg／g FW（鮮重），分別是對照的74和18倍。隨著NaCl濃度的增加，芨芨草根系中Pro含量上升的幅度大于葉片。芨芨草植株根系與葉片中Pro含量的急劇上升，說明芨芨草對NaCl脅迫的適應能力較強。

表1 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片Pro含量的變化Table 1 Changes of proline content in A.splendens under NaCl stress μg／g FW

2.2 NaCl脅迫對P5CS活性的影響

除200 mmol／L NaCl濃度脅迫時，芨芨草根系與葉片P5CS活性差異不顯著外（P＞0.05），其他濃度脅迫下，芨芨草根系中的P5CS活性均顯著高于葉片（P＜0.05）。在不同濃度NaCl脅迫下，除200 mmol／L濃度脅迫時，芨芨草根系中的P5CS活性與對照差異不顯著外（P＞0.05），其余濃度脅迫下，芨芨草根系中P5CS活性均顯著高于對照（P＜0.05）；NaCl濃度為300 mmol／L時，芨芨草葉片中P5CS活性顯著高于對照外（P＜0.05），其他濃度脅迫下，芨芨草葉片中P5CS活性均顯著低于對照（P＜0.05）。當NaCl濃度為300 mmol／L時，芨芨草葉片與根系中P5CS活性均達到最大值，為7.44和20.81 U／mg蛋白，分別為對照的1.1和6.3倍。在NaCl的脅迫下，隨著鹽濃度的增加，芨芨草葉片P5CS的活性呈“降－升－降”的趨勢（圖1）。

圖1 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片P5CS活性的變化Fig.1 Changes of P5CS in A.splendens under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對δ－OAT活性的影響

在NaCl脅迫下，芨芨草根系中的δ－OAT活性顯著高于葉片中的（P＜0.05）；芨芨草葉片與根系中的δ－OAT活性均顯著低于對照（P＜0.05），但在不同濃度的NaCl脅迫下，δ－OAT活性的變化幅度不大。隨著鹽濃度的增加，葉片與根系中的δ－OAT活性均呈先下降后上升的趨勢。當NaCl濃度為300和400 mmol／L時，芨芨草根系與葉片中的δ－OAT活性降至最低，較對照分別降低45.87%和72.24%（圖2）。這說明NaCl脅迫下，芨芨草中δ－OAT活性受到抑制，所以Pro含量的急劇上升可能不是通過鳥氨酸途徑合成的。

2.4 NaCl脅迫對ProDH活性的影響

在NaCl脅迫下，芨芨草葉片中ProDH酶的活性均顯著高于根系中的（P＜0.05），且均顯著高于對照（P＜0.05）。隨著NaCl濃度的增加，芨芨草葉片中ProDH的活性呈先上升后下降的趨勢，當NaCl濃度為200 mmol／L時，ProDH活性達到最大值，為66.04 U／g FW，是對照的1.7倍。芨芨草根系中的ProDH活性隨著NaCl濃度的增加變化不明顯，在濃度為100 mmol／L時，芨芨草根系中ProDH的活性上升到最大值為30.47 U／g FW，且顯著高于對照外（P＜0.05），其他濃度脅迫下，均差異不顯著（P＞0.05）。當 NaCl濃度為300 mmol／L時，芨芨草根系中ProDH 活性最小，為21.95 U／g FW，是對照的86.30%（圖3）。

3 討論

3.1 NaCl脅迫對芨芨草植株不同器官Pro含量的影響

在鹽脅迫下，Pro是公認的滲透保護劑，各組織中游離Pro含量的多少，直接關系到其抗逆性的強弱。Pro能防止水分散失，保護膜結構的完整性，所以細胞內Pro的升高可作為植物抗性的指標［22］。近年來對鹽脅迫下植物的生理代謝調節方面的研究表明，在鹽脅迫的條件下胞質內產生大量的滲透調節物質，在正常生長條件下，植物體內的游離Pro含量較低，但在鹽堿脅迫下，游離Pro的含量明顯增加［23］。陳托兄等［24］也指出：抗鹽植物中游離Pro多集中于代謝旺盛的光合器官和生殖器官，其Pro的含量是其他部位的數倍到數十倍，在鹽逆境下植物優先保護其光合器官和生殖器官，這是植物對鹽漬生境的一種生態適應對策。張金林等［25］研究表明：NaCl脅迫下，湖南稷子（Echinochloacrusgalli）地上部的游離Pro是根中的10倍多。吳欣明等［26］研究表明：隨NaCl濃度的升高，7份羊茅屬（Festuca）植物葉綠素和光合速率呈遞減趨勢，Pro呈增高趨勢。孟林等［27］同樣證實了NaCl脅迫下，34份偃麥草屬（Elytrigia）植物種質材料葉片的Pro隨脅迫濃度的增加而呈遞增趨勢，這與本試驗研究結果一致（表1）。芨芨草葉片中的Pro含量顯著高于根系中的，可能是由于在鹽逆境下植物為優先保護其光合器官和生殖器官，將根系中合成的Pro運輸到葉片。這與全先慶等［28］得出的Pro大多在植物的根中合成，而產物大部分被運輸到地上部分的研究結果一致。造成芨芨草植株地上部Pro積累的原因還可能與植株地上部光呼吸乙醇酸途徑的激活和Glu脫氫酶的活化相關［15］，還有待進一步的研究。Pro含量的大量增加，提高了緩解滲透脅迫的能力，從而增強了芨芨草植株在NaCl脅迫下的抗逆性。

圖2 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片δ－OAT活性的變化Fig.2 Changes ofδ－OAT in A.splendens under NaCl stress

圖3 NaCl脅迫下芨芨草根系與葉片ProDH活性的變化Fig.3 Changes of ProDH in A.splendens under NaCl stress

3.2 NaCl脅迫對芨芨草植株脯氨酸代謝途徑的影響

根尖部位是感知脅迫最敏感部位，植株受到的脅迫往往最先由根部感知，在此狀況下，其生理反應可能與葉片的生理反應不盡相同［4］。在NaCl脅迫下，除根系P5CS的活性顯著高于對照外（P＜0.05），芨芨草葉片中P5CS的活性、根系與葉片δ－OAT的活性均顯著低于對照（P＜0.05）。由此可見，芨芨草Pro的積累主要在根系中以谷氨酸途徑合成。研究表明，在滲透脅迫和低氮條件下谷氨酸途徑占主導地位，而在非脅迫條件及高氮條件下鳥氨酸又居于主導地位［29］。黃誠梅等［30］的研究也表明，滲透脅迫下，甘蔗（Saccharumofficinarum）幼苗葉片Pro生物合成以谷氨酸－Pro途徑為主。這與本試驗結論相一致。當NaCl的濃度高于300 mmol／L時，葉片P5CS的活性開始下降，可能是由于Pro濃度的大量增加，其活性受到Pro含量的反饋抑制［31］。ProDH是植物體內控制Pro降解的關鍵酶，在滲透脅迫時其表達活性受到抑制［30］。在NaCl脅迫下，芨芨草葉片中的ProDH的活性顯著高于根系（P＜0.05），主要是由于ProDH基因被Pro誘導而被滲透脅迫抑制［2］。可見，芨芨草Pro含量的積累是由合成和降解綜合作用的結果。

4 結論

NaCl脅迫下，芨芨草植株葉片的Pro含量顯著高于根系，芨芨草Pro含量隨NaCl脅迫濃度的增加而增加，當NaCl濃度達500 mmol／L時，Pro含量最大。

芨芨草植株根系P5CS活性顯著高于對照，在同一濃度脅迫下，根系活性均高于葉片；隨著NaCl濃度的增加，δ－OAT活性呈降低趨勢，均顯著低于對照；葉片ProDH活性高于對照，而根系ProDH活性較對照變化不太明顯。

NaCl脅迫下，芨芨草植株內Pro的積累主要以谷氨酸途徑為主。

［1］燕麗萍，夏陽，梁慧敏，等.轉BADH基因苜蓿T1代遺傳穩定性和抗鹽性研究［J］.草業學報，2009，18（6）：65－71.

［2］許祥明，葉和春，李國鳳.脯氨酸代謝與植物抗滲透脅迫的研究進展［J］.植物學通報，2000，17（6）：536－542.

［3］Akihiro U，Yuko Y Y，Tetsuko T.Salt stress enhances proline utilization in the apical region of barley roots［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，355：61－66.

［4］李玲，余光輝，曾富華.水分脅迫下植物脯氨酸累積的分子機理［J］.華南師范大學學報（自然科學版），2003，1：126－134.

［5］趙瑞雪，程鈺宏，董寬虎，等.植物脯氨酸及其合成酶系研究進展［J］.草業科學，2008，25（2）：90－96.

［6］支立峰，陳明清，余濤，等.p5cs轉化水稻細胞系的研究［J］.湖北師范學院學報，2005，25（14）：39－51.

［7］陳吉寶，景蕊蓮，毛新國，等.普通菜豆PvP5CS2基因對逆境脅迫的應答［J］.作物學報，2008，34（7）：1121－1127.

［8］徐春波，米福貴，王勇.轉基因冰草植株耐鹽性研究［J］.草地學報，2006，14（1）：20－23.

［9］Roosens N H，Bitar F A，Loenders K，etal.Overexpression of ornithineδ－arninotransferase increase proline biosynthesis and confers osmotolerance in transgenic plants［J］.Molecular Breeding，2002，9：73－80.

［10］趙福庚，劉友良.脅迫條件下高等植物體內脯氨酸代謝及調節的研究進展［J］.植物學通報，1999，16（5）：540－546.

［11］董社琴.芨芨草的生物學特性與生態經濟效益［J］.科技情報開發與經濟，2004，14（4）：190.

［12］陶錦，王果平，陳韓飛，等.鹽脅迫下芨芨草種子萌發中有機物及酶活性的變化［J］.石河子大學學報（自然科學版），2004，22（6）：504－506.

［13］王果平，康喜亮，陶錦，等.不同鹽濃度對芨芨草種子萌發過程中幾種生理指標的影響［J］.干旱地區農業研究，2006，24（2）：139－142.

［14］張耿，高洪文，王贊，等.偃麥草屬植物苗期耐鹽性指標篩選及綜合評價［J］.草業學報，2007，16（4）：55－61.

［15］Bates L S，Waldren R P，Teare I D.Rapid determination of free proline for water stress studies［J］.Plant Soil，1973，39：205－207.

［16］Kavi Kishor P B K，Hong Z，Miao G，etal.Overexpression of 1－pyrroline－5－carboxylate synthetase increases proline over production and confers osmo－tolerance in transgenic plants［J］.Plant Physiology，1995，108：1387－1394.

［17］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the qantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Analytic Biochemistry，1976，72：248－254.

［18］Garcia－Rios M，Fujita T，Larosa P C，etal.Cloning of a polycistronic cDNA from tomato encodingγ－glutamy kinase andγglutamyl phosphate reductase［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of USA，1997，94：8249－8254.

［19］Roosens N H，Thu T T，Iskandar H M，etal.Isolation of theomithine－δ－aminotransferase cDNA and effect of salt stress on its expression inArabidopsisthaliana［J］.Plant Physiology，1998，117：263－271.

［20］Kim H R，Rho H W，Park J W，etal.Assay of ornithine aminotransferase with ninhydrin［J］.Ana1ytical Biochemistry，1994，223：205－207

［21］Lutts S，Kinet J M，Bouharnlont J.NaCl－induced senescence in leaves of rice cultivars differing in salinity resistance［J］.Annals of Botany，1999，78：389－398.

［22］李紅，李波，趙洪波，等.誘變處理苜蓿愈傷組織抗堿性的研究［J］.草業科學，2009，26（7）：32－35.

［23］張永鋒，梁正偉，隋麗，等.鹽堿脅迫對苗期紫花苜蓿生理特性的影響［J］.草業學報，2009，18（4）：230－235.

［24］陳托兄，張金林，陸妮，等.不同類型抗鹽植物整株水平游離脯氨酸的分配［J］.草業學報，2006，15（1）：36－41.

［25］張金林，陳托兄，嚴學兵，等.烯效唑（S3307）對湖南稷子整株水平Na＋、K＋選擇性和游離脯氨酸分配的影響［J］.草業學報，2006，15（2）：42－47.

［26］吳欣明，王運琦，劉建寧，等.羊茅屬植物耐鹽性評價及其對鹽脅迫的生理反應［J］.草業學報，2007，16（6）：67－73.

［27］孟林，尚春艷，毛培春，等.偃麥草屬植物種質材料苗期耐鹽性綜合評價［J］.草業學報，2009，18（4）：67－74.

［28］全先慶，張渝潔，單雷，等.高等植物脯氨酸代謝研究進展［J］.生物技術通報，2007，1：14－18.

［29］Delauney A J，HuC A A，Kishor P B K，etal.Cloning of ornithine－aminotransferase cDNA fromVignaaconitifoliaby trans－complementation inEscherichiacoliand regulation of proline biosynthesis［J］.Journal of Biological Chemistry，1993，268：18673－18678.

［30］黃誠梅，楊麗濤，江文，等.聚乙二醇脅迫對甘蔗生長前期葉片水勢及脯氨酸代謝的影響［J］.干旱地區農業研究，2008，26（1）：205－208.

［31］王桂花，米福貴，劉娟，等.P5CS基因在蒙農雜種冰草植株中的表達及耐鹽性研究［J］.華北農學報，2007，22（4）：33－36.