DMN誘導(dǎo)的肝纖維化模型伴腎損害的實驗觀察

胡志峰，李 忻，何 燕，李 平△，肖 誠，潘 琳，郭景珍，張浩軍，路曉光，楊 鑫，張 韞

(1.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029;2.江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330006)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“肝腎同源”、“肝腎互補”，肝腎兩臟關(guān)系至為密切，但相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)目前尚不清楚。為了深入研究“肝腎同源”的病理生理機制，我們首次建立了二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化伴腎損傷復(fù)合動物模型。DMN具有明確的致肝纖維化作用，但是在腎損傷中的研究國內(nèi)還未見報道。本實驗旨在研究復(fù)合動物模型的同時，探討肝腎相關(guān)的可能物質(zhì)基礎(chǔ)，為指導(dǎo)臨床治療提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠16只，SPF級，體重80g±10g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK(京)2002-0003號。

1.2 藥物與試劑

DMN購自日本東京化成工業(yè)株式會社。透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)檢測試劑盒購自北方生物技術(shù)研究所。

1.3 儀器

全自動生化分析儀(美國CD-1600);BFG0152型放射免疫λ計數(shù)儀(北京核儀廠);滑走式切片機(日本SAKURA公司);顯微鏡(日本OLYMPUS公司);Image Pro Plus(IPP)Version 5.0圖像分析軟件。

1.4 分組及模型制備

將動物隨機分為2組，正常組、模型組各8只。參照金樹根等[1]的方法，DMN用生理鹽水稀釋成0.5%的濃度，以2 ml/kg的用量腹腔注射，每日1次，每周2次，共4周。正常組給予等劑量的生理鹽水腹腔注射。實驗結(jié)束用3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心獲得血清待測;取大鼠肝、腎組織，4%中性多聚甲醛緩沖液固定備用。

1.5 檢查項目

全自動生化儀檢測血清AST、ALT、BUN、SCr含量，放免試劑盒檢測纖維化指標(biāo)HA、LN和Ⅳ-C水平。

1.6 病理染色

肝、腎組織經(jīng)4%多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋，制備成4μm厚度切片。肝臟做HE、MASSON、天狼星紅染色，腎臟做HE、PAS、天狼星紅染色。采用IPP5.0軟件對肝腎天狼星紅染色的圖像分析定量。

1.7 免疫組化

肝、腎組織石蠟切片，用Envision二步法檢測TGF-β1、α-SMA的分布與表達，采用 IPP5.0軟件對圖像分析定量。

1.8 圖像分析

顯色結(jié)果采用IPP5.0圖像分析軟件，腎組織TGF-β1免疫組化染色每個切片隨機取10個腎小球，圖像放大400倍，測量陽性表達和腎小球面積，計算其比值并取平均值[2]。其他圖像分析指標(biāo)每張切片隨機取5個視野，圖像放大200倍，測量陽性染色面積，取平均值并計算其占視野面積的百分?jǐn)?shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間均數(shù)差異用單因素方差檢驗進行分析，以P<0.05作為判定有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 對血清肝腎功能的影響

表1顯示，模型組大鼠血清ALT、AST含量明顯上升，與正常組相比差異顯著(P<0.01，P<0.05);Scr、BUN含量亦明顯增高，與正常組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.05)。

2.2 血清纖維化放免檢測結(jié)果

表2顯示，模型組LN、Ⅳ-C和HA水平明顯升高，與正常組相比差異顯著(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

表1 DMN對大鼠血清肝腎功能的影響(n=8)

表2 DMN對大鼠血清LN、HA、Ⅳ-C水平的影響(ng/ml，n=8)

2.3 對組織的影響

肝組織:正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無變性、壞死，無炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生。模型組可見，肝細(xì)胞索排列紊亂，炎癥比較明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)及中央靜脈纖維組織增生，匯管區(qū)－中央靜脈區(qū)形成寬大的纖維間隔，假小葉形成(見圖1～3)。

腎組織:正常組腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。模型組在血管間質(zhì)可見小灶狀炎細(xì)胞浸潤，特別是在大的血管周邊部，并可見散在點狀壞死灶，基底膜輕度增厚，腎小管間質(zhì)可見膠原增生明顯(見圖4～6)。

圖1 肝臟HE染色(×200)

圖2 肝臟MASSON染色(×200)

圖3 肝臟MASSON染色(×200)

圖4 肝臟天狼星紅染色(×200)

圖5 腎臟PAS染色(×400)

圖6 腎臟天狼星紅染色(×400)

2.4 天狼星紅染色膠原面積圖像分析結(jié)果

表3顯示，在肝臟和腎臟，模型組較正常組膠原增生明顯(P<0.01)。

2.5 免疫組化圖像分析定量結(jié)果(見表4)

表3 天狼星紅膠原面積圖像分析結(jié)果(n=8)

表4 TGF-β1，α-SMA 免疫組化結(jié)果(%，n=8)

2.5.1 TGF-β1的表達 肝組織:正常組僅見于匯管區(qū)、中央靜脈周圍細(xì)胞有表達，且著色較淺、范圍窄。模型組則在匯管區(qū)、中央靜脈周圍及纖維間隔內(nèi)有大量表達，呈棕黃色顆粒狀，范圍廣，著色深(P<0.01)(見圖7)。

腎組織:正常組在腎小球有一個較弱的陽性表達，而模型組腎小球陽性表達明顯增多(P<0.01)(見圖8)。

2.5.2 α-SMA的表達 肝組織:正常組只在匯管區(qū)、小葉中央靜脈及分散在組織間的成纖維樣細(xì)胞中出現(xiàn)。模型組在肝實質(zhì)損傷區(qū)域大量出現(xiàn)，包括匯管區(qū)、肝纖維隔及肝竇等(P<0.01)(見圖9)。

腎組織:正常組只在血管壁上有表達，模型組在血管壁及小管周邊間質(zhì)部分均有表達，局部有的陽性表達彼此連結(jié)成一些小的不完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈細(xì)絲狀，甚至包繞腎小球(P<0.01)(見圖10)。

圖7 肝臟 TGF-β1免疫組化(×200)

圖8 腎臟 TGF-β1免疫組化(×400)

圖9 肝臟α-SMA免疫組化(×200)

圖10 腎臟α-SMA免疫組化(×400)

3 討論

肝腎同源是中醫(yī)的藏象理論，數(shù)千年來一直指導(dǎo)臨床的辨證和治療。早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“腎生骨髓，髓生肝”的論述，明代醫(yī)家李中梓結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗在《醫(yī)宗必讀》中首次提出著名的“乙癸同源”、“肝腎同治”的觀點。“乙癸同源”是指肝、腎的結(jié)構(gòu)和功能雖有差異，但其起源相同，密切相關(guān)。在先天，肝腎共同起源于生殖之精;在后天，肝腎共同受腎所藏的先后天綜合之精的充養(yǎng)，“腎生骨、髓，髓生肝”。“腎生骨、髓”，即腎生“骨”和“髓”，“髓”又分“骨髓”、“脊髓”、“腦髓”、“精髓”等，它們均由腎精化生，“藏真下于腎，腎藏骨髓之氣也”(《素問·平人氣象論》);腎為肝之母，肝為腎之子。“髓生肝”，即腎通過“髓”生養(yǎng)肝而發(fā)生母子聯(lián)系。“源”又可理解為事物之間相關(guān)聯(lián)的中心環(huán)節(jié)，故“乙癸同源”又即肝腎的結(jié)構(gòu)和功能體系通過某些中心環(huán)節(jié)而密切相關(guān)。“肝腎同源于精血”，意即肝腎的結(jié)構(gòu)和功能體系通過“精血”這一中心環(huán)節(jié)而密切相關(guān)。簡而言之，“乙癸同源”即“肝腎相關(guān)”，是人體內(nèi)肝腎結(jié)構(gòu)和功能協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體調(diào)控機制[3]。中醫(yī)“肝腎同源”反映了肝腎兩臟生理、病理和物質(zhì)屬性的同一性，預(yù)示了肝腎兩臟可能有相同生物活性物質(zhì)和靶細(xì)胞[4、5]。近年來不少學(xué)者對這一理論進行了深入研究。

DMN常用來建立肝纖維化模型，具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性，其活性代謝產(chǎn)物使核酸、蛋白質(zhì)等重要的生命物質(zhì)發(fā)生甲基化反應(yīng)，隨后導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死或凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進行性增加[6]。由于肝、腎纖維化具有一些內(nèi)在的共同發(fā)病規(guī)律和病理形態(tài)學(xué)特征，如均表現(xiàn)為致纖維化的細(xì)胞因子表達上調(diào)，ECM合成增多或降解減少，纖維過度增生等[7]，由此我們在腹腔注射DMN誘導(dǎo)動物肝纖維化的同時，觀察了其對腎損傷的影響。實驗結(jié)果表明，模型組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶酶活性增強，血清肝纖維化指標(biāo)LN、HA和IV-C水平顯著升高，肝組織結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成。同時還首次發(fā)現(xiàn)，DMN能夠誘導(dǎo)大鼠腎功能改變，血清SCr、BUN水平升高，腎小管間質(zhì)可見炎性浸潤，膠原增生明顯。

我們進一步采用免疫組化方法對肝腎α-SMA、TGF-β1的表達進行了研究，探討肝纖維化伴腎損傷時的作用機制。大量文獻證實，肝臟中α-SMA是肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、指示病程進展的重要標(biāo)志[8]。而TGF-β1為公認(rèn)的致肝纖維化最主要的細(xì)胞因子之一，主要通過自分泌和旁分泌方式參與活化、促進合成、抑制基質(zhì)降解來參與肝纖維化發(fā)展過程[9]。在腎臟中，α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致ECM過度沉積的主要細(xì)胞來源。TGF-β1表達升高與多種原因引起的腎纖維化密切關(guān)系，它與受體結(jié)合通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化靶基因產(chǎn)生一系列靶蛋白，使肌成纖維細(xì)胞增多，促進腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的發(fā)生[10～11]。本研究顯示，模型組大鼠肝腎α-SMA和TGF-β1表達顯著升高。

綜上所述，本文首次在DMN模型大鼠中觀察到肝纖維化并伴有腎損害，其機制可能是通過上調(diào)α-SMA和TGFβ1的表達而引起。這一方面為肝腎同源的病理相關(guān)性提供了實驗依據(jù)，另一方面似可認(rèn)為α-SMA和TGF-β1可能是肝腎相關(guān)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床和科研提供了有效的藥物篩選方法與治療思路。

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