泛耐藥銅綠假單胞菌的抗菌藥物聯合殺菌試驗

楊菁菁, 孫鐵英, 胡云建

銅綠假單胞菌是引起醫院獲得性肺炎的最常見的病原菌之一。近年來,隨著各種廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物等在臨床上的廣泛應用,及氣管插管、氣管切開、導管留置等有創檢查或治療手段的應用不斷增加,泛耐藥的銅綠假單胞菌(pan-drug resistant Pseudomonasaeruginosa,PDRPA)比率不斷上升。據我國2007年CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測顯示PDRPA檢出率為3.2%[1]。PDRPA引起的相關感染正逐漸成為臨床抗感染治療的難題。在目前臨床的藥敏試驗中,針對銅綠假單胞菌的藥敏試驗多數為單藥制劑(少數為β內酰胺類抗生素與酶抑制劑的復合制劑),聯合用藥對PDRPA的體外研究較少。近年來國外研究建立抗菌藥物聯合殺菌試驗(multiple combination bactericidal antibiotic test,MCBT)的方法[2],針對囊性纖維化患者的PDRPA展開研究,比較單藥治療及優化抗菌藥物組合,并且探討MCBT指導下的抗菌治療對臨床的意義。本研究采用MCBT方法,選擇急性呼吸道感染中的PDRPA,探討體外聯合抗感染治療的意義。

材料與方法

一、材料

(一)菌株來源、鑒定及藥敏試驗 收集2009年1月1日至2010年1月31日期間北京醫院臨床分離的20株PDRPA,菌株均采自痰或呼吸道分泌物標本。PDRPA：參照文獻[3],對臨床檢測的青霉素/酶抑制劑、頭孢菌素、碳青霉烯類、氟喹諾酮類及氨基糖苷類等抗菌藥物均耐藥的銅綠假單胞菌。同一患者的不同時間留取的菌株,僅取第1次分離菌株。

細菌鑒定采用VIT EK 2 COMPACT自動微生物鑒定系統進行菌株鑒定,藥敏試驗采用K-B法初篩,按CLSI標準判斷結果。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

(二)抗菌藥物的標準品和培養基

1.抗菌藥物標準品：選擇對銅綠假單胞菌有殺菌或抑菌作用的抗菌藥物共11種,其中殺菌劑9種(多黏菌素 B、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星),抑菌劑2種(米諾環素及阿奇霉素)。多黏菌素B購于Sigma-Aldrich公司(No.P4932),頭孢他啶與亞胺培南購自市售藥品(商品名分別為凱復定與泰能,純度分別為99%、99.5%),其余藥物標準品與對照品均購于中國藥品生物制品檢定所技術服務部。

2.抗菌藥物紙片：頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星和阿米卡星等抗菌藥物紙片均為OXOID公司產品。

3.培養基：大豆胰蛋白胨肉湯培養基(TSB)、Mueller Hinton(MH)肉湯培養基購于中國藥品生物制品檢定所技術服務部。陽離子調節的MH培養基(CAMHB)配制：按照MH肉湯培養基的使用說明,以25 g MH肉湯培養基粉末∶1 L雙蒸水的比例,并添加氯化鈣與氯化鎂,使鈣離子與鎂離子終濃度均為25 mg/L,即形成CAMHB。CaCl2貯存液配制：CaCl2?2H2O 3.68 g溶于100 mL蒸餾水中,即為含鈣離子10 mg/mL貯存液。MgCl2貯存液配制：MgCl2?6H2O 8.36 g,溶于 100 mL蒸餾水中,即為含鎂離子10 mg/mL貯存液。將氯化鈣與氯化鎂儲存液校正pH至7.2±0.1,121℃滅菌15 min,備用,以配制CAMHB。

二、方法

(一)最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定 受試菌株的MIC及MBC測定,按照CLSI指南中推薦的微量肉湯稀釋法,在除外米諾環素及阿奇霉素的9種殺菌劑中進行。以微量肉湯稀釋法培養24 h后,未見細菌生長的藥物最低濃度為MIC;從96孔板中未見細菌生長的各孔中吸取10 μ L培養液涂布于瓊脂平皿表面,35℃再培養24 h,能使原接種物菌量降低3 log的最低抗菌藥物濃度為MBC。

(二)MCBT

1.方法設計：參照文獻[2],MCBT在96孔微孔板中進行。制備各抗菌藥物儲液分裝凍存于-80℃冰箱,實驗當日制備10倍試驗濃度的抗菌藥物工作液。聯合的2種抗菌藥物各取10 μ L工作液加入同一微孔。細菌在MH瓊脂平皿上孵育過夜后,再挑取3～6個菌落至大豆胰蛋白胨肉湯培養基(TSB)中再培養4～6 h,將0.5個麥氏單位的對數生長期的細菌,以TSB稀釋100倍,每孔加入上述微生物培養液80 μ L,使每孔終濃度約為 5×105CFU/mL。以細菌生長孔(無抗生素)和無菌孔(無細菌接種物)作對照。96孔板置于35℃。觀察24 h和48 h的細菌生長狀態。48 h后,于未見細菌生長的孔中吸取10 μ L懸液置于5%血瓊脂平皿上,35℃培養24 h后,能使原接種物菌量降低3log的抗菌藥物聯合,被認為該組抗菌藥物聯合具有殺菌活性。實驗在不同日重復3次。

2.藥物濃度：主要依照藥物在單次靜脈或口服給藥后可達到的平均血清藥物濃度水平作為藥物濃度選擇的上限[2]。部分藥物(多黏菌素B、阿米卡星)對檢測的泛耐藥菌株取各自敏感性折點為MCBT使用的藥物濃度。MCBT中各藥物濃度與對應的2008年CLSI中銅綠假單胞菌折點標準的關系見表1。

3.名詞定義：參照文獻[4],本研究中“殺菌作用”、“無殺菌作用”及“拮抗作用”定義如下。①殺菌作用：在抗菌藥物存在的情況下,肉眼無混濁的微孔中傳代后仍無細菌生長。②無殺菌作用：抗菌藥物存在的情況下,微孔混濁或傳代后出現細菌生長。③拮抗作用：新加入的抗菌藥物與原可殺菌的抗菌藥物組合后出現細菌生長。討論中為比較棋盤法時,提及的“協同”、“相加”、“無意義”和“拮抗”按照棋盤法中計算的部分抑菌指數劃分。

(三)數據的處理與分析 采用SPSS 11.5統計軟件分析數據。組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

表1 MCBT中藥物濃度與2008年CLSI銅綠假單胞菌折點標準的關系Table 1.Antibiotic concentrations used in MCBT and corresponding 2008 CLSI breakpoints for P.aeruginosa

結 果

一、微量肉湯稀釋法測定 PDRPA的 MIC及MBC

臨床分離20株銅綠假單胞菌對頭孢他啶等8種抗菌藥物的紙片法藥敏試驗均呈耐藥,顯示為PDRPA。對該20株PDRPA通過微量肉湯稀釋法測定MIC與MBC值,見表2。20株PDRPA對多黏菌素 B敏感(MIC≤2 mg/L),但對阿米卡星(MIC≥64 mg/L)、哌拉西林-他唑巴坦(MIC≥128 mg/L)、頭孢他啶(MIC≥32 mg/L)、氨曲南(MIC≥32 mg/L)、亞胺培南(MIC≥16 mg/L)、美羅培南(MIC≥16 mg/L)、左氧氟沙星(MIC≥8 mg/L)和環丙沙星(MIC≥4 mg/L)均顯示耐藥。

表2 抗菌藥物對PDRPA的MIC及M BC測定(微量肉湯稀釋法)(mg/L)Table 2.Susceptibility of pan-drug resistant Pseudomonas aeruginosa to single antibiotics(mg/L)

二 、PDRPA 的 MCBT

(一)MCBT中單藥對PDRPA菌株的抑菌作用與殺菌作用 在MCBT的96孔板中,MCBT中單藥濃度與上文微量肉湯稀釋法所測得的各抗菌藥物的MIC相比較,基本保持一致。多黏菌素B單藥2 mg/L對19株細菌可達到殺菌作用,其中頭孢他啶單藥32 mg/L對5株細菌可達到殺菌作用,氨曲南單藥32 mg/L對2株菌可達到殺菌作用。其余各抗菌藥物MCBT設定的單藥濃度對所有菌株均無抑菌作用及殺菌作用。

(二)MCBT中產生殺菌作用的抗菌藥物聯合各菌株在96孔板中進行11種抗菌藥物54組聯合藥敏試驗。多黏菌素B與其他10種抗菌藥物的相應聯合的殺菌作用達到100%,未發現拮抗作用。其余抗菌藥物聯合的殺菌作用見表3。其中,因頭孢他啶與氨曲南的各自單藥濃度分別對5株菌與2株菌可達到殺菌作用,計算中分為達到殺菌作用的總菌株數與聯合用藥后產生殺菌作用的菌株數。

(三)MCBT中產生拮抗作用的抗菌藥物聯合在MCBT中的頭孢他啶、氨曲南的藥物選擇濃度下,各自對應5株、2株細菌在單藥下可達到殺菌作用。原對頭孢他啶單藥敏感的5株PDRPA,在阿奇霉素聯合頭孢他啶中產生拮抗作用;原對氨曲南單藥敏感的5株PDRPA,在阿奇霉素聯合氨曲南中亦均產生拮抗作用。

表3 抗菌藥物組合的殺菌活性Table 3.Bactericidal activity of antimicrobial agent combination against pan-drug resistant Pseudomonasaeruginosa isolates

討 論

近年來,國際范圍內銅綠假單胞菌耐藥的程度逐漸增加[10],不僅出現多重耐藥銅綠假單胞菌(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDRPA),超級耐藥銅綠假單胞菌(extensive drug resistantPseudomonasaeruginosa,XDRPA)、PDRPA也不斷增加。PDRPA引起的急性感染通常導致臨床預后極差,是臨床抗感染治療面臨的難題之一。針對此類菌株的感染,MCBT可協助篩選出相對適合的藥物聯合對細菌進行清除,通過較短時間(細菌分離、藥敏試驗后48～72 h),測定多種抗菌藥物聯合治療的體外敏感性[4]。相比常規的單一抗菌藥藥敏試驗,MCBT的結果對臨床治療急性MDRPA、PDRPA的感染,可能有更好的臨床指導意義。

本研究中,我院臨床分離的20株PDRPA菌株均對多黏菌素敏感(MIC≤2 mg/L),95%菌株的MBC未超過2 mg/L。這表明多黏菌素是體外對PDRPA最有效的抗感染藥之一,與文獻報道的基本相似[11]。多黏菌素為多黏類芽孢桿菌分離的脂肽類抗菌藥物,為環狀陽離子多肽抗生素,通過破壞細胞外膜磷脂,導致細胞通透性增高和細胞死亡[12]。但有研究觀察,在單獨使用多黏菌素治療數天內可逐漸發生耐藥甚至產生不良反應,更適合與其他抗菌藥物聯用[5]。因研究選擇的PDRPA菌株對多黏菌素單藥敏感,其聯合用藥的協同作用難以評估;而在部分文獻中報道,多黏菌素與阿奇霉素、亞胺培南、利福平等藥物有一定的協同作用[9]。

本研究顯示,阿米卡星聯合氨曲南、頭孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南等,可對實驗中部分PDRPA菌株達到殺菌作用,是本實驗中最有效的抗菌藥物組合;與多個相關研究結果相似[13-15]。而預期喹諾酮類藥物(左氧氟沙星、環丙沙星)可與β內酰胺類抗生素產生類似殺菌作用,但僅對實驗中1～2株菌株起到了殺菌作用;而未預計到的2種β內酰胺類抗生素的聯合卻表現出對部分菌株的殺菌作用：頭孢他啶聯合氨曲南、頭孢他啶聯合哌拉西林-他唑巴坦、哌拉西林-他唑巴坦聯合美羅培南。盡管體外聯合藥敏試驗結果顯示,氨基糖苷類和β內酰胺類抗生素聯合可能是治療PDRPA最有效的聯合之一,但實際在臨床中,PDRPA引起的急性感染非常棘手,尤其在面臨高齡患者、多臟器功能不全、免疫功能低下及并發感染中毒性休克等綜合因素的限制時,氨基糖苷類抗生素的不良反應使其臨床使用十分有限。有大規模研究比較β內酰胺類單藥與氨基糖苷類聯合β內酰胺類抗生素在感染性休克患者中的療效,兩者耐藥率相似但聯合用藥的不良反應增加,不推薦感染性休克中聯合使用氨基糖苷類抗生素[16]。而依照本實驗MCBT結果,在部分菌株中,2種β內酰胺類抗生素聯合的殺菌作用接近氨基糖苷類和β內酰胺類抗生素聯合的水平。與此相似,Song等[17]應用棋盤法檢測藥物聯合的有效性,亦支持頭孢他啶聯合氨曲南或頭孢吡肟聯合氨曲南等對部分銅綠假單胞菌有協同作用。2種β內酰胺類抗生素聯用產生殺菌作用,而相對不良反應小,可能對臨床用藥有一定的提示,但需說明,體內外存在差異,其是否發揮相似的殺菌作用,以及有無不良反應的發生等,可能需要更多的臨床數據來闡述。

此外,從上述MCBT的結果(表3)中比較2種碳青霉烯類抗生素(美羅培南與亞胺培南)在PDRPA中的差異：雖然兩者所取的濃度一致(8 mg/L),各自單藥均不能抑制所有20株細菌生長;但美羅培南聯合阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦等藥物時,均比亞胺培南聯合上述藥物時,對更多的菌株產生殺菌活性。這提示在我院的PDRPA菌株中,選擇碳青霉烯類抗生素聯合其他藥物治療時,美羅培南可能更有優勢。

與棋盤法相比,MCBT沒有棋盤法的濃度梯度,因此不能計算部分抑菌指數(FIC),不能將藥物組合的有效性細致地劃分為協同、相加、無意義及拮抗。但MCBT有更多的優勢：它能同時進行10余種藥物之間任意2種或2種以上抗菌藥物的聯合,完成棋盤法難以達到的多種藥物的組合數量,并且因所設計的濃度參照最高平均血清藥物濃度,可根據結果指導臨床用藥;避免了在棋盤法中MIC值高于血清最高血藥濃度的藥物聯合,即使存在協同或相加效應,而難以應用的情況。

面對PDRPA急性感染時,因不同菌株耐藥機制的差異,選擇個體化的MCBT較單藥的敏感性試驗和棋盤法更能幫助聯合抗菌藥物的選擇。本研究中阿米卡星與β內酰胺類抗生素的聯合、2種β內酰胺類抗生素的聯合顯示出對部分菌株的殺菌作用增強,可能有助于在臨床中抗菌藥物聯合用藥的選擇。MCBT與臨床抗感染治療關系的探討還需要進一步觀察研究。

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