沒食子酸對大鼠缺血再灌注損傷后細胞凋亡的保護作用及機制研究

卜麗梅,關鳳英,喬 萍,于艷華,趙麗紅,石 卓*

(1.吉林大學第一醫院干部病房,吉林長春130021;2.吉林大學白求恩醫學院藥理學系,吉林長春130021)

心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是指心肌經受較長時間缺血后得到血液灌注,此時并不能減輕缺血損傷,而是加重了損傷,甚至將可逆性損傷轉為不可逆性損傷,MIRI過程中,細胞凋亡有著重要的病理意義[1-2]。一旦心肌細胞受損啟動細胞凋亡程序,可導致心肌細胞數目減少和心功能的降低,加重MIRI。藥物預處理對缺血再灌注損傷心肌的保護成為目前的研究熱點之一[3]。我國具有悠久的中醫中藥歷史,中草藥資源豐富,開發前景廣闊。沒食子酸(gallic acid,GA),化學名3,4,5-三羥基苯甲酸,是可水解鞣質的組成部分,廣泛存在于葡萄,茶葉等植物中,是自然界存在的一種多酚類化合物來源于蓼科植物掌葉大黃根莖、桃金娘科植物大葉桉干燥葉、山茱萸科植物山茱萸的果實、千屈菜科植物千屈菜的花、馬桑科植物馬桑葉、石榴科植物石榴果皮等。已有文獻證實GA具有抗炎、抗突變、抗氧化等多種生物學活性,本實驗旨在以抗細胞凋亡為切入點,探討GA預處理對MIRI造成的細胞凋亡的影響及其可能存在的機制。

1 材料與方法

1.1動物、主要試劑及儀器Wistar大鼠,清潔級,體重200-250 g,由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。沒食子酸(gallic acid,GA)由預防醫學院化學實驗室提供,純度大于95%。丹參注射液。LDH、CPK、AST測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;GF-200半自動生化測定儀(山東高密彩虹儀器有限公司);

1.2動物模型制備大鼠冠脈結扎及再灌模型按文獻方法稍加改進[4],在20%烏拉坦麻醉下,將大鼠仰位固定于手術臺上,頸部正中分離氣管行氣管插管,開胸后接呼吸機。小動物呼吸機設定潮氣量為09、呼吸頻率為66-76次/min,吸呼比為1∶2,根據呼吸頻率及深度調整呼吸參數。自左側3-4肋間開胸,暴露心臟,于肺動脈圓錐及左心耳間找出冠脈左前降支,除假手術組僅穿線不結扎外,其余各組均以0號線立即結扎冠脈,打活結,將心臟送回胸腔。心電圖顯示S-T段抬高,并且T波與QRS波融合為結扎成功,各組動物在結扎40 min后,迅速打開結扎線進行再灌注,再灌注120 min。

1.3實驗分組和給藥實驗分組:wistar大鼠32只,隨機分為四組,每組8只。假手術組,只開胸穿線,不結扎LAD;缺血再灌注組(模型組),結扎LAD 40 min,再灌注120 min,于結扎前10 min舌下靜脈注射0.9%氯化鈉溶液;丹參組(DS),舌下靜脈注射丹參注射液100 mg·kg-1,余同模型組;沒食子酸組(GA),灌胃給沒食子酸 20 mg·kg-1,余同模型組。

1.4大鼠血清心肌三酶活性測定肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(AST)含量的測定:實驗結束后,腹主動脈取血,3 000 r/min離心10 min取血清。按試劑盒說明書比色法測定CK、LDH、AST含量。

1.5記錄大鼠不同時間點心電圖的變化心電圖ST段的測量大鼠固定后,于四肢皮下插入針形電極連接上海光電醫用電子儀器有限公司的ECG-6511型心電圖機。連續心電監測,并依次描記結扎前、缺血5、40 min和再灌注 10 min、120 min 時 Ⅱ導聯心電圖(紙速50 mm/s,增益1 mV=10 mm)。標準Ⅱ導聯心電圖的變化。

1.6心肌梗死范圍(MIS)的測定每組動物剖取心臟,用預冷的生理鹽水漂洗,除去血液及脂肪組織,用濾紙拭干,稱全心及心室濕重。將心室心肌橫切6片,然后浸入N-BT磷酸緩沖液中,置37℃恒溫水浴,待染色完全后取出,正常組織染色,缺血組織不染色。切下梗死心肌稱重,用梗死心肌與全心濕重的百分比計算MIS。

1.7心肌細胞凋亡檢測TUNEL染色按試劑盒提供的脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)原位檢測凋亡細胞的DNA碎片。各組實驗結束后,取心尖部位心肌常規脫水固定,石蠟包埋,切片,從各組取5張石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,PBS(pH7.2)沖洗(每次5 min,共 3 次,下同);蛋白酶K(20 μ g/ml)37℃消化 30 min,PBS沖洗;3%H2O2室溫下處理5 min以阻斷內源性過氧化物酶活性,PBS沖洗,含0.1%TritonX-100的0.1%枸櫞酸溶液以去除細胞膜表面污物,(冰上4 min),PBS沖洗;加 50 μ l TUNEL反應混合液,包括脫氧核苷酸轉移酶液,37℃孵育60 min,PBS沖洗,加POD液37℃孵育30 min,PBS沖洗,DAB顯色。在400×顯微鏡下,于缺血區邊緣隨機采集5個非重疊視野,檢測100個心肌細胞中TUNEL陽性細胞數,取其平均值。凋亡陽性率以單位面積內凋亡細胞數占細胞總數百分比表示。

1.8免疫組化法測定大鼠心肌Bax、Bcl-2的表達取心尖缺血梗死區橫切2 mm厚心肌,以PBS配成10%甲醛溶液固定,以免疫組化SP法觀察心肌細胞iNOS表達。操作步驟如下:(1)石蠟切片常規脫蠟至水;(2)3%H2O2常溫下孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶活性,蒸餾水沖洗,PBS浸洗5 min;(3)加山羊血清封閉液,室溫15 min清除背景非特異性染色;(4)滴加兔抗鼠Bax、Bcl-2抗體37℃孵育1h;(5)滴加生物素標記羊抗兔IgG,37℃孵育30 min;(6)加辣根酶標記鏈霉素卵白素,37℃孵育30 min;(7)上述(3)(4)(5)后均以 PBS洗3 min×3次;(8)DAB顯色,自來水充分沖洗,蘇木素復染,封片。陰性對照以PBS代替一抗進行孵育,其他步驟同上。陽性反應:細胞漿呈棕褐色為Bax、Bcl-2蛋白陽性表達。Image-pro軟件分析計算各組陽性表達細胞的光密度值。

2 結果

2.1GA對大鼠血清CK、LDH及AST的影響大鼠缺血40 min,再灌120 min后,取血測定血清CPK、LDH及AST活性。結果與假手術比較,再灌注模型組血清CPK、LDH及AST活性明顯升高(P＜0.01),與再灌注模型組相比,GA能降低血清CK、LDH及AST三酶的活性(P＜0.05或P＜0.01),見表1。

2.2GA對缺血-再灌注大鼠心電圖的影響缺血-再灌注使實驗各組部分大鼠心臟出現室性心律失常,所有大鼠均有ST段抬高,其中假手術組變化不明顯,模型組及DS組、GA組與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.01),表明結扎及再灌均引起心肌缺血損傷;模型組與DS組、GA組比較差異有統計學意義(P＜0.05),表明DS、GA對心肌缺血有一定的緩解作用,見表2。

表1 GA對大鼠血清CK、LDH及AST的影響(n=8,s)

與假手術組比較,#P＜0.01;與模型組比較,*P＜0.05

分組 CK(U/L)LDH(U/L)AST(U/L)假手術組 328.12±159.4 330.3±64.2 104.4±40.6模型組 1230.4±213.5# 1193.0±223.1# 436.0±106.4#DS 886.3±97.8#* 894.25±280.3#*294.7±67.5#*GA 880.9±161.0#* 797.7±320.9#*304.8±72.4#*

表2 GA對心肌缺血再灌注大鼠心電圖 ST段的影響(n=8,s)

表2 GA對心肌缺血再灌注大鼠心電圖 ST段的影響(n=8,s)

與假手術組比較aP＜0.01;與模型組比較bP＜0.05

分組 結扎前 結扎后5 min 結扎后40 min 再灌后10 min 再灌后120 min假手術組 1.0±0.1 1.2±0.2 1.0±0.3 1.1±0.3 1.0±0.2模型組 1.1±0.2 6.3±1.1a 7.5±0.7a 7.9±1.0a 8.2±0.4a DS 1.1±0.1 5.3±0.9a 6.7±0.3ab 7.3±0.8a 7.4±0.6ab QKL 1.0±0.15 5.2±0.7ab 6.6±0.4ab 6.8±0.5ab 6.6±0.3ab

2.3GA對心肌損傷范圍及凋亡率的影響大鼠缺血40 min再灌120 min,取心肌染色,以損傷心肌占全心濕重的百分比來計算MIS。與假手術組比較,再灌注模型組MIS明顯的大面積損傷(P＜0.01),表明大鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。與再灌注模型組相比,DS組及GA組均能明顯縮小MIS(P＜0.05或 P＜0.01),見表3。

TUNEL染色結果表明凋亡陽性細胞呈深棕色,細胞核萎縮,染色質聚邊,胞漿不著色。SH組存在少量凋亡細胞,I/R組可見大量凋亡細胞,與SH組比較差異具有顯著性(P＜0.001);GA組和DS組凋亡細胞百分率低于模型組,差異具有顯著性(P＜0.05)。見圖1和表3。

Fig.1 GA對實驗性缺血再灌注損傷大鼠心肌TUNEL染色陽性細胞數的影響(400×)

表3 GA對心肌損傷面積(%)和細胞凋亡率的影響(s,n=6)

表3 GA對心肌損傷面積(%)和細胞凋亡率的影響(s,n=6)

###P＜0.001,compared with SH group;*P＜0.05,compared with I/R group;⊿P＜0.05 compared with AS(5 g·kg-1)group

分組 動物數(只)損傷面積(%)凋亡率(%)假手術組 8 0 2.0±0.2模型組 8 42.30±2.5# 17.3±1.8###DS 8 32.16±3.8#* 11.9±2.2*GA 8 33.05±5.2#* 16.7±2.5⊿

2.4GA對Bax、Bcl-2的影響Bax、Bcl-2在胞漿中成片表達,呈棕黃色。在假手術組Bax、Bcl-2均有表達,但量較小,Bax與Bcl-2相近。與假手術組比較,缺血再灌模型組Bax、Bcl-2表達均明顯增高。與模型組比較,GA組Bax蛋白含量顯著減少,Bcl-2蛋白含量顯著增多。GA具有抗大鼠心肌缺血再灌注損傷作用,其機制可能通過調節Bcl-2/Bax比值介導心肌缺血再灌注細胞凋亡而實現。(圖2、3)

圖2 GA對促凋亡蛋白Bax表達的影響

圖3 GA對抑凋亡蛋白Bcl-2表達的影響

3 討論

MIRI過程中細胞凋亡有著重要的病理意義,病理學認為,細胞凋亡機制與心肌短暫缺血后再灌注損傷密切相關[5]。姚震等[6]研究表明,不同時間的心肌缺血再灌注損傷均可導致心肌細胞凋亡,以缺血30-60 min后再灌注時明顯,說明心肌細胞凋亡的發生率與此前心肌缺血時間長短有關。再灌注損傷引起的細胞凋亡多分布于短暫缺血后血管再通的相關部位和梗死灶的收縮帶區域。

本研究觀察到,與假手術組比較,模型組心肌三酶的漏出量增加,心肌梗死面積和細胞凋亡率提高。預先給予GA可明顯減輕心肌三酶的漏出量、心肌梗死面積明顯縮小,細胞凋亡率顯著降低,說明GA對實驗大鼠心肌缺血-灌注損傷后細胞凋亡具有明顯的保護作用。

表4 GA對Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(n=8,s)

表4 GA對Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(n=8,s)

而與假手術組比較#P＜0.01,與模型組比較*P＜0.01

分組 劑量 Bcl-2 Bax bcl-2/bax假手術組 —— 38.24±4.38 38.24±4.38 1.03±0.2模型組 —— 96.23±12.10#* 96.23±12.10#* 0.36±0.041 DS 100mg·kg-1 75.38±10.28#* 75.38±10.28#* 1.26±0.342 GA 20mg·kg-1 74.41±9.56#* 74.41±9.56#* 3.51±0.372

細胞凋亡與某些凋亡相關基因表達及調控有關,其中,細胞凋亡由細胞內凋亡相關基因直接控制,bax基因與bcl-2基因具有高度的同源序列,bcl-2和bax是兩個重要的相關基因,前者抑制細胞凋亡,而后者促進細胞凋亡[7]。Bax蛋白與Bcl-2蛋白可相互結合形成結合體,過度表達Bax蛋白可促進細胞凋亡并抑制 Bcl-2的抗凋亡作用。因此,Bax和Bcl-2表達的比例決定細胞是生存還是凋亡[8-9]。GA組大鼠心肌細胞Bcl-2表達顯著增高,而Bax蛋白顯著降低,Bax/Bcl-2顯著下降,細胞陽性染色面積百分率顯著降低,提示GA可能通過調控Bax/Bcl-2的比值抑制I/R心肌細胞發生凋亡,減輕I/R損傷。

Bax促進細胞凋亡的可能機制除bax本身具有促進細胞凋亡作用外,還可通過①bax與bcl-2形成異源二聚體,抑制bcl-2的作用,并可抑制bcl-2家族中bcl-xL等基因的抑制凋亡作用;②bax/bax形成同源二聚體,抑制線粒體細胞色素C的釋放,促進細胞凋亡[10]。本實驗結果顯示,缺血再灌注使bcl-2和bax的表達明顯增多,但以bax的增多更為顯著,使bcl-2/bax值顯著降低,細胞凋亡明顯。而給予GA治療組bcl-2表達增加,bax表達下降,bcl-2/bax值升高,心肌細胞凋亡數量明顯減少。由此推測,GA抑制心肌細胞凋亡可能是其縮小梗死面積、保護心肌的機制之一,而抑制心肌缺血再灌注引起細胞凋亡的機制可能與下調bax和上調bcl-2的蛋白表達,提高bcl-2/bax比值有一定關系,直接證據有待進一步驗證。

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