依達拉奉改善大鼠血腦屏障損傷的AQP-4機制研究

張 衍 王煥成 宋明愛

河南南陽市第一人民醫院 南陽 473000

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)腦水腫是影響患者病情程度及預后的重要因素,而后期血腦屏障損傷引起的血管源性腦水腫是主要的原因。由于伊文斯藍具有不能透過血腦屏障的特性,本實驗以檢測腦組織中伊文斯藍(EB)含量來分析腦出血后血腦屏障和AQP-4的關系,進一步探討依達拉奉改善腦出血大鼠血腦屏障損傷的AQP-4機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年S-D雄性大鼠90只,由新鄉醫學院動物實驗中心提供,體質量280～300g。標準飼料喂養和自由飲水,保持室溫20～25℃及恒定的濕度。按數字表隨機分為對照組、模型組、依達拉奉組各30只。每組在隨機分為術后6h、1d、3d、5d、7d 5個時相點,每個時相點下 6 只。

1.2 實驗方法 (1)模型組:以4%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉。參考Hua等[1]方法固定大鼠。頭正中切約lcm的縱切口,暴露前囟,使微量注射儀套管尖端移至前囟前0.5mm,左側中線旁 3mm,用大針頭鉆孔,穿透顱骨。用40℃水溫浴鼠尾約10min取出擦干,在距鼠尾末端約5mm處剪斷,用微量注射儀吸新鮮血液約50μ l,迅速插入鉆好的孔內,向內進針6mm。在 2.5min內注入,留針5min后緩慢退針。拔針后無血液自針道返流,蘇醒后出現神經功能缺損癥狀視為造模成功。(2)對照組:前期操作同模型組,但不注血液。(3)依達拉奉組:建模前每隔12h腹腔注射依達拉奉2mg/kg直到相應的時相點,對照組及模型組用等量的生理鹽水腹腔注射。

1.3 檢測方法

1.3.1 干鮮質量的測定:取血腫中心前半分區腦組織,準確稱重置于100～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重后,稱取干質量,根據公式:腦組織含水量(%)=(鮮質量-干質量)/鮮質量來計算,精確度為0.1。

1.3.2 血腦屏障通透性測定:采用伊文思藍甲酰胺法,大鼠處死前1 h經尾靜脈注入2%EB(2ml/kg),稱取血腫內側部分置于甲酰胺(1ml/100g腦組織)中60℃孵育 24h。1000 r/min,離心5min,分光光度計(λ=632nm)測定上清液OD值,根據標準曲線計算出EB含量。

1.3.3 AQP-4免疫組化檢測:常規脫水,加一抗 AQP-4(1∶50),加生物素標記山羊抗兔IgG,脫片,顯微鏡下觀察。棕黃色為強陽性,黃色為陽性,淺黃色為弱陽性,與間質顏色一致者為陰性。隨機采集5個高倍視野(10×40),采用雙盲法計算每個高倍鏡視野AQP-4陽性細胞表達率。

2 結果

見表 1、2、3、4。

表1 腦出血后不同時間點腦含水量 ()

表1 腦出血后不同時間點腦含水量 ()

注:與假手術組比較,*P＜0.05;與ICH組同一時間點比較,#P＜0.05

組別 n腦含水量(%)6h 1d 3d 5d 7d對照組 30 79.26±0.75 79.27±0.77 79.27±0.70 79.28±0.75 79.26±0.71模型組 30 79.96±0.68 83.38±0.55 84.15±0.61 83.65±0.52 81.70±0.37依達拉奉組 30 79.78±0.40 80.02±0.31* 82.25±0.49*# 80.12±0.50*# 79.70±0.58#

表2 腦出血后不同時間點腦組織EB含量 ()

表2 腦出血后不同時間點腦組織EB含量 ()

組別 n 腦組織EB含量(OD/g)6h 1d 3d 5d 7d對照組 30 0.308±0.006 0.308±0.056 0.310±0.034 0.309±0.028 0.307±0.030模型組 30 0.585±0.085* 0.879±0.086* 0.792±0.051* 0.569±0.097* 0.447±0.09*依達拉奉組 30 0.359±0.071#* 0.593±0.052*# 0.527±0.049*# 0.385±0.044*# 0.291±0.039*

表3 腦出血后不同時間點腦組織AQP-4表達含量 ()

表3 腦出血后不同時間點腦組織AQP-4表達含量 ()

組別 n 腦組織AQP-4表達率(%)6h 1d 3d 5d 7d對照組 30 16.98±0.90 16.98±1.00 16.98±0.96 16.98±0.99 16.98±0.98模型組 30 19.48±0.65 26.56±1.44* 43.34±2.73* 49.86±1.76* 20.47±1.41*依達拉奉組 30 18.42±0.26 23.37±1.56*# 40.54±2.14*# 45.04±1.97*# 18.32±1.79#

表4 EB含量與AQP-4表達的相關分析

3 討論

AQP-4是近年來研究比較多的一類水特異性膜內在蛋白,為水分子跨膜轉運提供了一個全新的分子結構基礎,對于維持機體的水平衡起著重要作用,并且與水平衡紊亂所造成的一些疾病有密切關系[2]。AQP-4廣泛存在于中樞神經系統的星形膠質細胞膜、蛛網膜下腔、血管周圍的膠質細胞、室管膜細胞、脈絡叢及下丘腦滲透壓感受區器官,并認為其在中樞神經系統作為滲透壓感受器有介導和調節水的運輸和平衡的作用。在生理條件,水通道基本上是處于激活狀態,水轉運過程很快,一般不需門控和其他調節,而在腦出血后6 h,水腫區的陽性細胞數增多,陽性細胞體積增大,AQP-4表達增強,第 3天達高峰,此后逐漸回落,但 1周后仍明顯高于正常。已有研究表明,AQP-4不僅參與腦組織水代謝的生理和病理過程,而且可能與調節腦脊液的形成及細胞外液容積的變化有關,參與腦水腫的多種生理、病理過程發生腦水腫時AQP-4表達增加,是星形膠質細胞適應細胞外環境變化的反應,同時AQP-4又促進了星形膠質細胞水腫的發生和發展,而AQP-4表達的下調或缺陷對減輕腦水腫程度、降低病死率和致殘率有重要作用。這顯示AQP-4在腦組織水的運輸中起關鍵性作用,且提示調節AQP-4變化可能為減輕各種腦疾病所致腦水腫提供新的治療方法。

腦出血后腦水腫主要是血腦屏障受損,通透性增加,血漿滲出引起的血管源性腦水腫。本實驗顯示腦出血后血漿中AQP-4的濃度出現了明顯的增高,隨著AQP-4含量的增高,腦水腫也隨之明顯加重,到 72h達高峰。表明 AQP-4的大量產生與腦水腫發生之間有一定的關系。本實驗結果還顯示,腦出血后AQP-4的濃度從6h逐漸增高,腦水腫的變化趨勢與之大致相同,5d達峰值,7d開始下降。腦出血組腦組織EB含量在腦出血后6h上升,1～3d達到高峰后緩慢下降,1d與 3d相比無顯著性差異(P＞0.05),推測 BBB通透性的高峰出現在1～3d。BBB通透性與AQP-4表達的相關分析顯示二者呈顯著正相關,表明腦出血后AQP-4表達的上調可能引起BBB的開放,使BBB通透性增加。腦含水量在腦出血后6h也開始升高,3d達到高峰,之后開始下降,7d仍然高于正常,與AQP-4表達的變化一致,二者呈顯著正相關,與文獻報道一致。腦出血后AQP-4表達水平和腦含水量在相應時間點上均高于對照組,提示AQP-4表達的上調導致腦含水量的增加,說明AQP-4與腦出血后腦水腫的形成有密切關系。本實驗中依達拉奉組與出血組相比,BBB通透性高峰出現的時間趨于一致,但峰值明顯降低,其他時間點腦組織內EB含量也低于腦出血組,表明依達拉奉能顯著降低BBB的通透性,依達拉奉組AQP-4表達及腦含水量在各時間點均低于腦出血組,說明應用依達拉奉能夠降低腦出血后腦內AQP-4的表達及腦含水量。

自由基清除劑依達拉奉是目前臨床試驗證明惟一有效的自由基清除劑[3],具有自由基清除和抑制脂質過氧化的作用,可以抑制腦細胞(血管內皮細胞和神經細胞)的過氧化作用,靜脈給藥后可清除腦內的具有高度細胞毒性的羥基基團。體內試驗顯示[4],依達拉奉還能抑制血管內皮細胞損害,抑制腦水腫、改善神經功能。

[1]Hua Y,Schallert T,Keep RF,et al.Behavioral test after intracerebral hemorrhage in the rat[J].Stroke,2002,33(10):2478-2484.

[2]Kiening KL,Frank KH,Landeghem V,et al.Decreased hemispheric aquaporin-4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats[J].Neuroscience Letters,2002,324(2):105-108.

[3]渡邊俊明,幸敏志,齊藤健一,等 .新規腦保護藥 MCI-186藥理學的檢討[J].藥理與治療,1997,25(suppl7):S181-S188.

[4]陳勇,高樸,常娜,等.依達拉奉治療腦出血的臨床療效觀察[J].中國實用神經疾病雜志,2008,11(6):104-105.