半夏、鉤藤乙醇提取物4∶1配伍對青霉素誘發驚厥大鼠癇性放電的影響1)

徐 寧,王 莉,牛爭平,孫美珍

癲癇是腦神經元異常放電反復發作引起的突然短暫腦功能紊亂的臨床綜合征[1]。中醫藥治療癲癇已有兩千多年歷史,在治療癲癇方面積累了豐富的經驗。半夏超臨界CO2乙醇提取物可劑量依賴性對抗小鼠最大電休克和戊四唑驚厥[2]。半夏、鉤藤4∶1合用時抗癲癇效應協同、毒性拮抗[3]。為進一步證實兩藥4∶1配伍后的協同抗癲癇效應,本研究進一步觀察了半夏、鉤藤提取物單藥及4∶1配伍對青霉素(PNC)皮層定位注射誘發大鼠驚厥發作和癇性放電的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級 Wistar大鼠,體重180 g～220 g,合格證號為:314第070102號,雌雄皆用,單籠喂養;由山西醫科大學實驗動物中心提供,符合國家健康一級動物標準。

1.1.2 藥品與試劑 藥品:鉤藤(Uncariae,UN)、半夏 Pinellia ternate(PT)均購于山西省藥材公司,由山西醫科大學藥學系植化教研組老師鑒定。半夏、鉤藤的乙醇回流提取:將生藥材粉碎成 20目,加入相當于藥材量的6倍體積的70%乙醇后,浸泡24 h,然后用回流方法加熱煮沸兩次,每次2 h,紗布過濾,合并兩次濾液,用旋轉蒸發儀(濃縮溫度60℃,壓力 9 M pa)濃縮成800%(W/V)溶液,置冰箱冷藏備用,使用時用蒸餾水稀釋至所需濃度。托吡酯(Topamax),瑞士 Cilag公司生產,批號02CS063。用生理鹽水配制。試劑:青霉素鈉(Benzylpencillin Sodium),華北制藥股份有限公司生產,冀衛藥準字(1995)第000004號,批號U0204033;烏拉坦(Urethane),上海曹楊第二中學化工廠生產,批號820420;用蒸餾水配置至所需濃度。

1.1.3 儀器 旋轉蒸發器RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠制造;DZTW型調溫電熱套,北京市永光明醫療儀器廠制造;江彎Ⅰ型-C腦立體定向儀,上海川沙花木農機廠制造;RM6240C型多道生理信號采集處理系統,成都儀器廠制造。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 取Wistar大鼠稱重并灌胃(ig)受試藥物后,腹腔注射25%烏拉坦 0.4 mL/100 g麻醉,固定于江彎Ⅰ型-C腦立體定向儀上,腦正中矢狀切口切開頭皮3cm,剝離骨膜,按照Konig定位圖譜在大鼠左側額葉皮層(前囟后3 mm,中線旁2 mm,硬腦膜下0.5 mm)和海馬(前囟后3.8 mm,中線旁2.0 mm,硬腦膜下2.6 mm)區分別將兩根直徑0.5 mm的不銹鋼電極插入相應部位作為引導電極,并與RM6240C多道生理信號采集處理系統相連。于各藥作用高峰期用微量注射器硬膜下(感覺運動皮層)定位注射青霉素400 U,當腦電圖出現尖波、棘波或尖(棘)慢波綜合波時造模成功。

1.2.2 實驗動物分組及給藥 取Wistar大鼠36只,隨機分為5組,每組6只。對照組(假手術組)給予生理鹽水;模型組(PNC組)給予生理鹽水;托吡酯組予 0.154 g/kg托吡酯;半夏組予36.4 g/kg半夏;鉤藤組予38.5 g/kg鉤藤;半夏和鉤藤聯合組予24.5 g/kg;以上各組均采用皮層定位注射給藥。

1.2.3 觀察指標 行為觀察參照Racine分級標準[4]。硬膜下注藥后連續觀察大鼠行為1 h,并記錄癇性發作的潛伏期和發作程度。以注藥到首次出現須動所需的時間為潛伏期;以出現Ⅲ級～Ⅳ級發作為重度發作,僅出現Ⅲ級或Ⅲ級以下輕度發作。腦電觀察指標:將電極插入額葉及海馬后與 RM6240C多道生理信號采集處理系統相連,并將腦電信號輸入電腦,用RM6240C軟件進行腦電信號的頻譜分析。硬膜下微量注射青霉素后,連續記錄腦電圖5 min,以后每5 min記錄1 min至1 h,同時觀察大鼠的行為變化。當出現尖波、棘波、尖(棘)慢波綜合波、多棘慢波時判定為癇性活動。觀察并統計癇性放電的潛伏期、放電最高波幅、癲癇波發放頻率。以注射青霉素到首次出現癇性放電波的時間為潛伏期,取 10個1 min EEG中的尖波或棘波數目的均數作為每分鐘平均癇波發放頻率。

2 結 果

2.1 行為學比較 模型組6只大鼠(100%)在注入PNC后開始發作即表現為節律性四肢同時抽動(Ⅳ級),持續至實驗結束(1 h)。鉤藤單藥組和半夏單藥組有5只大鼠出現Ⅲ級以下的輕型發作,其中只有1只發展為Ⅳ級發作,持續20 min恢復正常。聯用組和托吡酯組各有4只大鼠出現輕型發作,均未發展為重型發作,發作持續20 min后轉為正常。癇性發作的潛伏期以聯用組為最長,依次為托吡酯組、半夏單藥組、鉤藤單藥組。與模型組相比有統計學意義(P＜0.05)。與兩單藥組相比,聯用組均較之延長(P＜0.05),而與托吡酯組比較在數值上有所延長,但無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 半夏、鉤藤提取物對大鼠驚厥發作潛伏期和發作程度的影響

2.2 腦電圖比較 正常大鼠大腦海馬及皮層腦電圖以9/min～10/min或17/min～19/min的α、β波為主要表現,無明顯節律性,波幅0.04 mV～0.07 mV。正常對照組大鼠ig后,腦電無明顯改變。模型組硬膜下注射PNC 63.46 s±11.55 s(海馬),69.73 s±14.04 s(皮層)后開始出現癇波,多為尖波、棘波和棘慢波。癇波的發放頻率為40.17/min±3.97/min(海馬),40.50/min±5.68/min(皮層),波幅最高可達1.09 mV±0.11 mV(海馬)、1.32 mV±0.36 mV(皮層)。詳見表2、表3。

表2 半夏、鉤藤提取物對驚厥大鼠海馬癇性放電潛伏期、癇波發放頻率和最高波幅的影響(±s)

表2 半夏、鉤藤提取物對驚厥大鼠海馬癇性放電潛伏期、癇波發放頻率和最高波幅的影響(±s)

組別 劑量 癇性放電潛伏期s癇波發放頻率t/m最高波幅mV模型組63.46±11.55 40.17±3.97 1.09±0.11半夏組 36.4 g/kg 119.36±17.981) 20.50±7.961) 0.62±0.251)鉤藤組 38.5 g/kg 117.54±12.811) 22.83±9.541) 1.00±0.301)聯用組 24.5 g/kg 183.26±19.751)2)3)4) 21.17±5.271) 0.82±0.272)托吡酯組 0.154 g/kg 129.04±7.551) 25.00±4.341) 1.13±0.22與模型組比較,1)P＜0.01;與托吡酯組比較,2)P＜0.05;與半夏組比較,3)P＜0.05;與鉤藤組比較,4)P＜0.05

表3 半夏、鉤藤對驚厥大鼠皮層癇性放電潛伏期、癇波發放頻率和最高波幅的影響

2.2.1 癇性放電潛伏期比較 海馬腦電圖結果中癇性放電潛伏期以聯用組為最長,其余依次為托吡酯、半夏單藥組、鉤藤單藥組,與模型組相比均可延長癇性放電的潛伏期(P＜0.01)。聯用組分別與兩單藥組和托吡酯組相比,均能顯著延長潛伏期(P＜0.05)。皮層腦電圖結果顯示,皮層癇性放電潛伏期實驗結果同海馬,只有數值上的不同。各組皮層和海馬腦電圖的潛伏期的組間比較無統計學意義(P＞0.05)。

2.2.2 癇性放電頻率比較 海馬腦電圖癇波發放頻率以半夏單藥組為最少,其余依次為聯用組、鉤藤單藥組、托吡酯組,與模型組相比癇波發放頻率均顯著減少(P＜0.01)。聯用組與兩單藥組相比,無統計學意義(P＞0.05)。

2.2.3 癇波最高波幅比較 海馬腦電圖結果中只有半夏單藥組癇波最高波幅與模型組相比有降低(P＜0.01)。皮層腦電圖結果可以看出,半夏、鉤藤單藥組癇波最高波幅與模型組相比均有統計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

中醫理論認為,癲癇的病因是由多種因素導致痰濁內生,痰聚而氣逆不順,或氣郁化火,火生風動,挾痰上蒙清竅,橫竄經絡,內擾神明,而致癲癇發作[5],在治療上以化痰、熄風、瀉火、祛瘀、行氣、補氣等為治療原則。中藥配伍是中藥臨床應用的主要形式。《本經》提出充分利用相須、相使等協同增效配伍,以提高療效;對有毒副反應的藥物,則利用相制配伍,以抑制毒性,保證安全用藥;對某些確有可能引起藥效下降(相惡)或產生不良反應的(相反),則避免合用。馬融等[6]認為痰邪是造成癲癇的中心環節,五志過極化火生風夾痰,上犯清竅;或因臟腑嬌嫩,卒受驚恐,氣機逆亂,痰濁隨氣上逆,蒙閉心神是本病的主要病機。按中藥合理配伍原則,本實驗選取平肝熄風藥鉤藤和化痰藥半夏提取物進行4∶1配伍,觀察了配方的抗驚厥作用。研究表明,半夏和鉤藤合用不但對抗青霉素誘發的驚厥行為活動,同時可明顯抑制異常腦電活動。表現在顯著延長癇性發作潛伏期和癇性放電的潛伏期,且該作用較兩藥單獨應用時強。

青霉素是經典的致癇劑,其急性或點燃癲癇動物模型已獲公認。對于青霉素誘發的癲癇活動隨其給藥方法的不同而異,如果是腹腔或側腦室給藥,癇性活動與人類失神性癲癇相似,如果是大腦皮層一側運動區定位注射則與人類簡單部分性發作類似[7],如果是顳葉給藥,則與人類精神運動性發作類似。青霉素為α-氨基丁酸(GABA)受體阻斷劑[8],它引起的發作可能是由于它與GABA受體結合,阻斷了與受體偶聯的氯離子通道,從而阻斷了GABA引起的突觸后抑制的結果。當神經元興奮性突觸后電位(EPSP)綜合超過一定閾值即可產生陣發性去極化飄移(paroxymal depolarization shifts,PDS)。PDS是癲癇電生理學的主要特征之一,腦電圖記錄到的棘波就是PDS有關動作電位的反映[9]。半夏和鉤藤乙醇提取物單用和4∶1配伍用藥能明顯抑制青霉素皮層定位注射誘發的癇性放電,雖然兩藥單用和合用對癇波發放頻率及最高波幅的抑制作用無差異,但延長癇性放電潛伏期和降低最高波幅作用較托吡酯明顯,且作用性質與托吡酯相似。托吡酯能增強小腦顆粒細胞GABA介導的Cl-內流,其抗癲癇機制可能與GABA系統功能增強有關[10]。可以認為半夏和鉤藤合用通過抑制青霉素皮層定位注射誘發的癇性放電和驚厥行為而對簡單部分性癲癇發作產生良好的對抗作用,推測其抗癇作用機制與影響GABA系統有關。

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