人腦干和幕上膠質瘤N-cadherin和β-catenin mRNA的表達

馬俊艷,武文浩,田永吉,歷俊華,張力偉,萬虹,郝淑煜,李德志,陰魯鑫

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤,其中腦干膠質瘤是惡性程度較高的腫瘤,比其他部位膠質瘤侵襲性強、預后差。臨床研究發現,腦干膠質瘤絕大多數呈彌漫性生長,而幕上膠質瘤往往呈局限性生長,并且幕上膠質瘤患者的預后明顯好于腦干膠質瘤,但其中的具體機制目前仍不清楚。近年來,N-cadherin和相關因子β-catenin在膠質瘤侵襲性的發生及發展中的重要作用已成為研究的熱點[1-3]。本文擬采用RT-PCR方法分別檢測N-cadherin和β-catenin mRNA在腦干和幕上膠質瘤中的表達,探討N-cadherin和β-catenin及其復合體在腦干和幕上膠質瘤發病中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集首都醫科大學附屬天壇醫院神經外科顱底腦干病區2008年1月～2009年11月手術切除的18例腦干膠質瘤和18例幕上膠質瘤標本,均經病理科診斷確診。標本離體后均立即保存于液氮罐中。病例中男性23例,女性13例,平均年齡37歲。根據1999年WHO確定的病理分級標準將其劃分為4級:Ⅰ級1例、Ⅱ級19例、Ⅲ級 3例、Ⅳ級13例。其中低級別(Ⅰ～Ⅱ級)腦干和幕上膠質瘤各10例,高級別(Ⅲ～Ⅳ級)腦干和幕上膠質瘤各8例。

總RNA提取液TRIzol:北京金馳同信科技發展有限公司;引物:Invitrogen Biotechnology Co.,Ltd;PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及DNA Marker:TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

取樣本100 mg,研磨后用 TRIzol法提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性,DNA核酸分析儀測OD260/OD280比值(1.9～2.1),計算核酸濃度。RTPCR反應按TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說明書操作:5 μ g 模板 RNA 、20 μ l RT 體系 、50 μ l PCR體系。

引物序列 :N-cadherin:上游:5′-GTG CCA T TA GCC AAG GGA AT T CAG C-3′;下游 :5′-GCG TTC CTG TTC CAC TCA TAG GAG G-3′;β-catenin:上游 :5′-ACC TCC CAA GTC CTG TAT GAG TG-3';下游 :5′-CAT CTG AGG AGA ACG CAT GAT-3′;GAPDH(內參):上游 :5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′;下游:5′-TTG AT T TTG GAG GGA TCT CG-3′。

PCR反應條件:預變性94℃、5 min,變性94℃、30 s,退火53 ℃、45 s,延伸 72 ℃、45 s,共進行30個循環,最后延伸72 ℃、10 min。

1.2.2 RT-PCR反應產物相對定量分析 每一樣本以管家基因GAPDH作為內參照。RT-PCR結果用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳結果用Gel-Pro凝膠分析系統行掃描及灰度分析,對陽性電泳條帶進行吸光度峰值下面積積分,每一樣本計算N-cadherin和βcatenin與GAPDH條帶吸光度積分的比值,此值為各樣本mRNA的相對量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 11.5統計軟件對 N-cadherin和β-catenin在不同病理級別、不同部位膠質瘤之間的比較進行獨立樣本t檢驗。對N-cadherin和β-catenin在腦干和幕上膠質瘤中的相互關系采用相關分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 N-cadherin 在高級別腦干膠質瘤中,5例標本呈強陽性表達,3例呈中等強度表達;在低級別腦干膠質瘤中,7例呈中等強度表達,3例呈弱陽性表達。在高級別幕上膠質瘤中,2例標本呈強陽性表達,3例呈中等強度表達,3例呈弱陽性表達;在低級別幕上膠質瘤中,2例呈強陽性表達,3例呈中等強度表達,5例呈弱陽性表達(圖1)。N-cadherin mRNA在腦干和幕上膠質瘤中的表達無顯著性差異(P＞0.05);在幕上膠質瘤高低級別間的表達無顯著差異(P＞0.05);在腦干膠質瘤高低級別間有顯著性差異(t=2.711,P＜0.05)。見表1。

2.2 β-catenin 在高級別腦干膠質瘤中,5例標本呈強陽性表達,3例呈中等強度表達;在低級別腦干膠質瘤中,2例標本呈強陽性表達,6例呈中等強度表達,1例呈弱陽性表達。在高級別幕上膠質瘤中,5例標本中等強度表達,3例呈弱陽性表達;在低級別腦干膠質瘤中,2例標本呈強陽性表達,3例呈中等強度表達,5例呈弱陽性表達(圖2)。β-catenin mRNA在腦干膠質瘤中的表達高于幕上膠質瘤(t=2.255,P＜0.05)。βcatenin mRNA在腦干和幕上各級別膠質瘤中的表達無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 N-cadherin和β-catenin與GAPDH電泳條帶的面積積分比值

圖1 N-cadherin RT-PCR電泳結果

圖2 β-catenin RT-PCR電泳結果

2.3 相關性分析 N-cadherin和β-catenin mRNA在腦干(r=0.480)和幕上(r=0.809)膠質瘤中的表達均呈正相關(均P＜0.05)。

3 討論

腦干是人體生命中樞,由于腦干解剖結構和功能的特殊性,目前對腦干膠質瘤的研究只限于臨床觀察。本研究首次從轉錄水平研究比較了腦干和幕上膠質瘤中N-cadherin和β-catenin的表達,對腦干膠質瘤的生物學特性作了初步探討。

N-cadherin分子量約為130 kDa,主要分布于神經和肌肉組織,是一類介導細胞間同質黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白,在神經軸突的導向生長、靶向識別以及突觸形成中起重要作用,多種信號轉導成分參與上述過程的調控。目前對于膠質瘤中N-cadherin的研究,國外文獻報道并不一致。Asano等研究發現,N-cadherin表達的減少與膠質瘤侵襲行為增強和腫瘤復發有關,并認為 N-cadherin表達與周邊浸潤呈負相關[4]。而Utsuki等發現,N-cadherin表達的增加與膠質瘤侵襲行為增強有關[5]。體外實驗表明,給N-cadherin表達陰性的癌細胞轉染N-cadherin后,細胞的侵襲性明顯增強[6]。國內文獻報道均認為,N-cadherin的表達隨著膠質瘤級別的升高而增高[7]。但目前關于N-cadherin表達變化的具體機制以及在腦干膠質瘤中的表達報道較少。本研究首次從轉錄水平檢測了腦干和幕上膠質瘤中N-cadherin mRNA的表達,發現在腦干和幕上膠質瘤中N-cadherin mRNA的表達無顯著差異,而高級別腦干膠質瘤中N-cadherin mRNA表達量顯著高于低級別腦干膠質瘤;臨床研究表明,腦干膠質瘤絕大多數呈彌漫性生長;推測N-cadherin與腦干膠質瘤的病理分級及較強侵襲性關系密切。

β-catenin分子量為92 kDa,是原癌基因編碼的黏附蛋白,主要調節細胞黏附系統,影響組織結構和形態發生;此外,β-catenin還是 Wnt信號傳導通路的重要成分。有研究表明,β-catenin具有致癌作用,是癌細胞增殖的重要促進因子,隨著膠質瘤惡性程度的增高,β-catenin的表達亦增高[8-9]。Pu等對45例不同級別的膠質瘤進行 RT-PCR檢測,結果顯示,β-catenin基因在各級膠質瘤中的mRNA表達無顯著性差異[10]。本實驗研究了腦干和幕上膠質瘤中β-catenin mRNA的表達,結果顯示β-catenin mRNA在腦干膠質瘤中的表達顯著高于幕上膠質瘤,提示β-catenin是導致腦干膠質瘤較幕上膠質瘤侵襲性較強的關鍵因素之一;此外,雖然在高低級別腦干膠質瘤中β-catenin mRNA的表達無顯著差異,但β-catenin mRNA在高低級別腦干膠質瘤的表達均有增強的趨勢,可能表明其與腦干膠質瘤的惡性增殖活性有關。但造成腦干膠質瘤預后差的主要原因是由于腫瘤本身的侵襲性還是其特殊的解剖結構遭到破壞所致,還需進一步研究。

細胞黏附性的改變是腫瘤侵襲與轉移的重要始動環節。β-catenin與cadherin家族連接形成cadherincatenin功能復合體,調節細胞黏附系統。本實驗結果顯示,β-catenin與N-cadherin在腦干和幕上膠質瘤中的mRNA表達均呈正相關,提示N-cadherin-β-catenin復合體在腦干和幕上膠質瘤的惡性生物學行為中都起著重要作用。但N-cadherin與β-catenin在不同部位膠質瘤中表達為何差異較大,還需進一步研究。

[1]Tanuma N,Nomura M,Ikeda M,et al.Protein phosphatase Dusp26 associates with KIF3 motor andpromotes N-cadherin-mediated cell-cell adhesion[J].Oncogene,2009,28:752-761.

[2]Nakajima S,Doi R,Toyoda E,et al.N-cadherin ex pression and epithelial-mesenchymal transition in pancreatic carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(12 Pt 1):4125-4133.

[3]Lindner I,Hemdan NY,Buchold M,et al.Alpha2-macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding beta-catenin signaling[J].Cancer Res,2010,70(1):277-287.

[4]Asano K,Duntsch CD,Zhou Q,et al.Correlation of N-cadherin expression in high grade gliomas with tissue invasion[J].Neurooncol,2004,70(1):3-15.

[5]Utsuki S,Oka H,Sato Y,et al.E,N-cadherins and beta-catenin expression in medulloblastoma and atypical teratoid/rhabdoid tumor[J].Neurol Med Chir(Tokyo),2004,44(8):402-407.

[6]Li G,Satyamoorthy K,Herly n M.N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells[J].Cancer Res,2001,61:3819-3825.

[7]李斐,江普 查,袁先 厚,等.N-cadherin 、E-cadherin 及 β-catenin 在 膠質瘤中的表達及意義[J].中國臨床神經外科雜志,2007,12(9):536-539.

[8]Nelson WJ,Nusse R.Convergence of Wnt,beta-catenin and cadherin pathways[J].Science,2004,303(5663):1483-1487.

[9]Tian Q,Jin H,Cui Y,et al.Regulation of Wnt gene expression[J].Dev,Growth Differentiation,2005,47(5):273-281.

[10]Pu P,Zhang Z,Kang C,et al.Downregulation of Wnt2 and betacatenin by siRNA suppresses malignant glioma cell growth[J].Cancer Gene Ther,2009,16(4):351-361.