基于均勻設計法優化紫肉甘薯高效快繁體系

顧地周 ，陳林 ，馮穎 ，姜云天

（1.通化師范學院生物系，吉林通化，134002；2.吉林省通化市靖宇中學）

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]具有產量高、穩產性好、抗逆性強、用途廣等特點，是我國第四大糧食作物。近年來，隨著經濟的發展，甘薯的消費轉向以加工和鮮薯食用為主，甘薯的科研轉向淀粉加工、優質食用、莖葉菜用、特用（高花青素、高胡蘿卜素、無β-淀粉酶）等專用型品種的選育與開發利用為主。紫肉甘薯因富含花青素，具獨特的色彩、食用風味及護肝、降血糖、抗癌等保健功效，作為鮮薯食用為人們所青睞，作為原料開發的薯片、薯醬、色素等產品的市場前景廣闊。因其常規繁殖時萌芽少，大面積推廣栽培和應用受到極大的限制。因此，對其進行離體高效快繁尤為重要。通過愈傷組織再分化芽苗途徑具有增殖系數高等優點，但仍存在外植體誘導愈傷組織周期較長、獲得不定芽速度較慢，且愈傷組織長期連續增殖極易發生退化和變異等缺點。而相對于愈傷組織再分化芽苗過程，腋芽增殖并同時生根途徑不僅成苗速度快，繁殖系數高，而且遺傳穩定性強，一步成苗，大大提高了種苗生產效率。同時，應用均勻設計對紫肉甘薯嫩莖的腋芽伸長生長和莖段生根條件進行篩選，以期獲得最佳培養條件。目前同屬其他種植物的組織培養已有報道[2～3]，但關于紫肉甘薯高效快繁的報道迄今未見。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的處理

4月初，采紫肉甘薯嫩莖（引自福建省泉州市農業科學研究所選育的泉紫薯1號品種）在實驗室內水培促使腋芽萌發。待腋芽萌發并長至3.0 cm時剪下，在超凈工作臺上用70%酒精涮洗60 s，用飽和次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無菌水沖洗10次，用無菌濾紙吸干表面水分，切除被殺菌消毒劑損傷部分后切割成一葉一段作為外植體備用[1]。

1.2 紫肉甘薯腋芽萌發生長及莖段生根培養基的篩選

以改良MS（1/4大量元素、1/3微量元素、1/3鐵鹽和1/3有機成分）為基本培養基，附加蔗糖20 g/L，瓊脂粉 8.5 g/L，pH 值 5.7，溫度（24±2）℃，光照強度1 100 lx，光照周期10 h/d。待外植體嫩莖段的腋芽萌發長至2.0 cm時，將其切下后切割成一葉一段接種到附加不同濃度的IAA、IBA、NAA和 GA3的改良MS培養基上進行腋芽伸長生長及生根培養，篩選最適宜的培養基。

1.3 高效快繁體系的建立

以節培法進行快繁[2～3]，以紫肉甘薯再生植株的莖節為材料，即切割成一葉一段轉接到優化后的腋芽伸長生長及生根培養基中進行節增殖及生根培養。統計計算出增殖周期和倍數。

1.4 數據分析

數據分析與處理采用均勻設計 （Uniform Design）軟件。回歸分析均采用全回歸（后退法）。

2 結果與分析

2.1 改良MS培養基中不同植物生長調節物質濃度交叉配比對紫肉甘薯腋芽生長及莖段生根的影響

待外植體嫩莖段的腋芽萌發后長至2.0 cm時，將其切下后切割成一葉一段轉接到附加不同濃度的IAA、IBA、NAA和GA3的改良MS培養基中進行腋芽伸長生長及生根培養，由預試驗可知濃度范圍分別為 IAA 0.10～0.40 mg/L，IBA 0.10～0.30 mg/L，NAA 0.07～0.12 mg/L 和 GA31.10～1.80 mg/L， 低于控制范圍的植物生長調節物質不能促使紫肉甘薯生根和腋芽伸長生長；過高的植物生長調節物質導致幼苗基部膨脹或產生愈傷瘤和抑制腋芽萌發生長，繼續培養根從膨脹部或愈傷瘤上發出，這樣的苗在移栽時，根隨愈傷瘤從苗基部脫落，移栽成活率幾乎為零，可能是根與苗莖的纖維疏導組織連接不完整所致。為了提高紫肉甘薯植株再生的速度和再生率，采用均勻設計法[4～6]，每個處理 30株，選用U10（104）均勻表（表 1），同時考察了 IAA、IBA、NAA和GA3濃度交叉配比對紫肉甘薯腋芽伸長生長及生根的影響，考察再生率以腋芽伸長生長和莖段生根為標準，結果見表2。

所得數據經均勻設計軟件處理，得回歸方程Y=120-97.9X1+17.5X2-10.0X3-13.1X4，樣本容量 N=10，顯著性水平 α=0.01，復相關系數 R=0.999 1，檢驗值 Ft=720.9，臨界值 F（0.01，4，5）=11.39，Ft＞F（0.01，4，5），顯著，說明回歸方程有意義。對各方程項進行顯著性檢 驗 可 知 ： 檢 驗 值 F（3）=0.671 6， 臨 界 值 F（0.01，1，5）=16.26，F（3）≤F（0.01，1，5），此方程項不顯著,需要剔除。剔除不顯著方程項，新建回歸方程繼續計算:得回歸方程Y=119-98.1X1+18.3X2-13.0X4，復相關系數R=0.999 0，檢驗值 Ft=1 017，臨界值 F（0.01，3，6）=9.780，Ft＞F（0.01，3，6），回歸方程顯著。 同理對各方程項進行顯著性檢驗可知：各方程項對Y影響均顯著。根據回歸方程求出 Y的最優組合為：X1=0.10，X2=0.30，X4=1.10，在此組合基礎上求得最優解：y=100，此解為方程解析解，需按公式Y=y±Uα·s計算出優化值區間估計為 Y=100±2.00，即 98.0%～102.0%。以最優組合做試驗驗證，將紫肉甘薯嫩莖段接種到附加IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L的改良MS培養基中，培養10 d嫩莖基部開始出現根錐，18 d后腋芽開始萌動生長，繼續培養至23 d嫩莖基部直接發出3～5條不定根（圖1a），28 d后苗高可達3.0 cm以上，有的產生了側根，根和苗的形態、發育均正常，再生率達99.5%以上。在估計區間范圍內，且比所有試驗Y值都大。可見，紫肉甘薯腋芽萌發生長及生根的最佳培養基為：MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L。

表1 U10(104)因素及水平設計 mg/L

表 2 U10(104)均勻設計實驗安排及結果

2.2 高效快繁體系的建立

采取節培法進行繼代快繁，待紫肉甘薯莖段生根的苗伸長至5.0 cm以上時，在超凈臺上打開培養瓶留一葉剪下苗干，將其切割成一葉一段再轉接到嫩莖段生根同時腋芽伸長生長的培養基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L中進行節增殖和生根培養。21 d為1個增殖周期，每瓶增殖倍數平均達50以上（圖1b）。

圖1 紫肉甘薯組培圖（a為外植體莖斷的初代培養；b為腋芽增殖及生根；c為移栽。）

2.3 煉苗和移栽

待苗根長至3.0 cm以上時，從培養瓶中取出試管苗，在含有3 mg/L殺毒礬溶液中洗去苗上殘留的瓊脂，然后植入經20倍殺毒礬消毒過的腐爛松針、泥炭土和細河砂（2∶1∶1）混合的基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，濕度保持在80%，溫度控制在（20±2）℃，每天自然光照8 h，每天中午通風換氣15 min，7 d后揭去薄膜，每天早晚噴灑清水各1次，成活率達98%以上（圖1c）。

3 結論與討論

試驗結果表明，培養基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L對紫肉甘薯腋芽伸長生長及莖段生根的誘導效果顯著，IAA和IBA的同時加入促進了莖段的生根率和生根速度，在培養基中添加1.10 mg/L的GA3促進了腋芽的萌發和伸長生長；繼代快繁采取節培法，以紫肉甘薯再生植株的莖節為材料，即切割成一葉一段轉接到優化后的腋芽伸長生長及生根培養基MS（改良）+IAA 0.10 mg/L+IBA 0.30 mg/L+GA31.10 mg/L中進行節增殖和生根培養，遺傳穩定性好，速度快、成苗率高，從而縮短了增殖周期，提高了增殖倍數，方法簡捷，經濟實用，可操作性強，達到了快速增殖的目的。應用均勻設計法處理和分析數據大大縮短了培養基配方的摸索周期。本研究已成功建立了紫肉甘薯的高效離體快繁體系，達到了預期目的；這可能對紫肉甘薯品種（系）的生產及工廠化育苗有一定的參考意義。

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