薄層色譜法在中藥蟲草顆粒質(zhì)量研究中的應(yīng)用

鄭美娟（漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建漳州363000）

薄層色譜法在中藥蟲草顆粒質(zhì)量研究中的應(yīng)用

鄭美娟
（漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建漳州363000）

目的對中藥蟲草顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制研究，確保制劑質(zhì)量的可控性。方法利用薄層色譜法，對川貝母、人參、苦杏仁、陳皮等君藥進(jìn)行定性和蟲草主藥的定量控制，并通過方法學(xué)驗證。結(jié)果確定蟲草的含量限度為本品含發(fā)酵蟲草菌粉以腺苷（CloHl3N504）計算，每克不得少于0.10 mg，折算成每克蟲草菌粉含腺苷的量為1.85mg。結(jié)論本測定方法和含量限度的制定合理。

薄層色譜法；中藥；蟲草顆粒；質(zhì)量研究

本文利用薄層色譜法，對中藥蟲草顆粒中川貝母、人參、苦杏仁、陳皮等君藥進(jìn)行了定性和蟲草主藥的定量控制，并通過了方法學(xué)的驗證，最終確定蟲草的含量限度為本品含發(fā)酵蟲草菌粉以腺苷（CloHl3N504）計算，每克不得少于0.10mg。通過定性和定量控制標(biāo)準(zhǔn)的制訂，確保了藥品質(zhì)量的可控性，從而為該制劑科學(xué)生產(chǎn)提供了充分的實驗依據(jù)［1-5］。

1 儀器與材料

1.1 儀器薄層色譜掃描儀，CS-9301日本島津；紫外可見分光光度計，751GD上海天普分析儀器廠；電子天平，1／10000上海天平儀器廠；電熱真空干燥箱，DZF-1B蘇通州銳鋒制藥機(jī)械有限公司。

1.2 材料與試劑橙皮苷、人參皂苷、西貝堿、腺苷、苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品，均由中國藥品生物制檢所生產(chǎn)；層析用硅GF254分析純，青島硅創(chuàng)精細(xì)化工有限公司；氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、異丙醇、正丁醇、乙醚分析純均由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。樣品：090601、090602、090603，漳州市藥品檢驗所。

2 實驗方法

2.1 川貝母鑒別（1）川貝母供試液的制備：取樣品10 g，置50 mL錐形瓶中，加濃氨試液5 mL、氯仿20mL，密塞浸泡過夜，超聲提取30 min，分取氯仿層，藥渣及堿液再加氯仿15mL，超聲提取30min，合并氯仿液，蒸干，殘渣加氯仿1mL溶解，作為供試品溶液。（2）對照溶液的制備：取西貝堿對照品，加氯仿制成每1mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。（3）薄層層析：照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄VIB）［6］試驗，吸取供試品溶液30μL，對照品溶液3μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯-甲醇-濃氨水（10∶10∶2∶1）的上層溶液為展開劑，置氨蒸氣充分飽和的層析缸內(nèi)，展開，取出，晾干。噴以稀碘化鉍鉀試液，供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點。

2.2 人參的鑒別（1）供試液的制備：取樣品10 g，加水飽和的正丁醇20 mL，超聲處理30 min，然后置分液漏斗中，加3倍量的氨試液，振搖提取，分取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲酵1mL使溶解，作為供試品溶液。（2）對照溶液的制備：取人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。（3）薄層層析：照薄層色譜法［6］試驗，吸取上述供試品溶液10μL，對照品溶液3μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（26∶16∶6）100℃以下放置的下層溶液為展開劑，展距15 cm，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點，紫外光燈（365 nm）下顯相同的熒光斑點。

2.3 陳皮的鑒別（1）供試液的制備：取樣品3 g，加甲醇10mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL，作為供試品溶液。（2）對照溶液的制備：取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。（3）薄層層析照薄層色譜法［6］試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點。

2.4 苦杏仁的鑒別（1）供試液的制備：取本品1 g，加乙醚回流2次，每次30 mL，1 h，棄去乙醚液，殘渣加甲醇30 mL，置水浴上加熱回流30 min，放置至室溫，濾過，濾液加活性碳2.5 g，攪拌，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加醋酸乙酯20 mL提取，棄去醋酸乙酯溶液，殘渣揮干，加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。（2）對照溶液的制備：取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。（3）薄層層析：照薄層色譜法［6］試驗，吸取上述供試品溶液15μL，對照品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）5～10℃放置12 h下層溶液為展開劑，展開，取出，立即噴以磷鉬酸硫酸溶液（磷鉬酸29，加水20 mL使溶解，再緩緩加入30 mL硫酸，混勻），在105℃烘約10 min，供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的藍(lán)色斑點。

2.5 蟲草的含量測定

2.5.1 色譜條件（1）薄層板制備：用4%Na2HPO4·12H2O的0.5%CMC-Na溶液-硅膠GF254（3∶1）濕法輔板，厚度為0.5 mm，晾干，于105℃活化1 h備用。（2）展開、顯色條件：氯仿-醋酸乙酯-異丙醇-水-濃氮試液（8∶2∶6∶0.5∶0.3），在紫外光燈（254 nm）下確定斑點的位置。（3）掃描方式：反射法鋸齒掃描：SX＝3，光束：0.4 mm×0.4 mm。（4）掃描波長：腺苷在264 nm處有最大吸收，參比波長為365 nm。（5）供試液的制備：取樣品5 g，研細(xì)，精密稱定，加90%甲醇60mL回流提取1 h，放冷濾過，藥渣再加90%甲醇50mL回流提取30min，放冷濾過，藥渣用90%甲醇洗滌3次，每次10mL，濾過，合并90%的甲醇液，水浴蒸干，殘渣加水15 mL溫?zé)崾谷芙猓靡颐烟崛?次，每次20mL，棄去乙醚液，水溶液水浴加熱蒸去乙醚后，用水飽和正丁醇提取5次（30 mL×2次，15 mL×3次），合并正丁醇提取液，水浴蒸干，殘渣加90%甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用90%甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。（6）對照溶液的制備：取腺苷對照品加90%甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液。

2.5.2 樣品測定方法照薄層色譜法［6］試驗，吸取上述供試品溶液8μL，對照品溶液3μL和5μL，交叉點于同一4%磷酸氫二鈉制備的硅膠GF254薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-異丙醇-水-濃氨試液（8∶2∶6∶0.5∶0.3）為展開劑展開，展距12 cm，取出晾干，置紫外光燈（254 nm）下定位，照薄層色譜法進(jìn)行掃描，波長λS＝264 nm，λR＝365 nm，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計算，即得。

3 結(jié)果

3.1 檢測方法正確性

3.1.1 專屬性腺苷測定中無干擾物質(zhì)存在，說明該方法專屬性良好。

3.1.2 線性關(guān)系考察用定量毛細(xì)管吸取2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μL對照品溶液（0.246 mg／mL）點于同一4%Na2HPH2O的0.5%CMC-Na為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，按上述展開條件展開，展距12 cm，紫外光燈（254 nm）下定位，按上述條件掃描測定，回歸方程為Y＝129 3.2X+59.637，r＝0.999 7，說明腺苷在0.492～1.476μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗用定量毛細(xì)管吸取對照品溶液4μL、供試品溶液8μL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線方法點樣、展開、定位，在相同條件下于不同時間連續(xù)掃描測定吸收度積分值，試驗表明，腺苷斑點在4 h內(nèi)吸收度積分值基本不變。

3.1.4 精密度試驗用定量毛細(xì)管吸取對照品溶液4 μL、供試品溶液8μL，分別點于同一4%Na2HPO4· 12H2O的0.5%CMC-Na為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，各5個點，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法展開、定位，掃描測定，結(jié)果對照品RSD為1.43%，供試品RSD為1.68%。

3.1.5 加樣回收試驗取本品（批號090602）約5 g，研細(xì)，精密稱定，精密加入腺苷對照品約0.6mg，供試品點樣量為4μL，對照品點樣量為3μL和5μL，平均回收率為99.41%，RSD為1.22%。

3.2 腺苷含量測定結(jié)果

3.2.1 發(fā)酵蟲草菌粉含量測定結(jié)果取發(fā)酵蟲草菌粉約0.3 g，精密稱定，測得腺苷含量，結(jié)果表1。

表1 發(fā)酵蟲草菌粉含量測定結(jié)果

3.2.2 樣品測定結(jié)果取樣品約5 g，研細(xì)、精密稱定，測得3批樣品的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

4 討論

蟲草顆粒是由13味中藥組成的復(fù)方，其蟲草菌粉占總處方的5.4%，腺苷是水溶性較強(qiáng)的化合物；由于蟲草顆粒處方中的方藥富含水溶性成分，采用高效液相色譜法測定蟲草顆粒中的腺苷成分水溶性成分干擾太多，結(jié)果不能運(yùn)行腺苷的含量測定。采用薄層色譜法測定蟲草顆粒的腺苷含量，陰性無干擾，因此改用了薄層掃描方法測定腺苷含量。含量限度定為本品含發(fā)酵蟲草菌粉以腺苷（CloHl3N504）計算，每克不得少于0.10mg，折算成每克蟲草菌粉含腺苷的量為1.85mg，與單味蟲草菌粉組成的中成藥“金水寶膠囊”的含量限度相比略低些，因為蟲草菌粉在處方成品中的含量測定是有一定的轉(zhuǎn)移率的［7］。因此筆者認(rèn)為，本測定方法和含量限度的制定合理。

［1］馮孝章.發(fā)酵蟲草菌絲體的質(zhì)量分析［M］.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)年鑒，1990：201-210.

［2］衛(wèi)生部.中藥材［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1992：25-27.

［3］梁生旺.中藥制劑定量分析［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997：110-115.

［4］張力.冬蟲夏草的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)通報，1988，23（5）：520-522.

［5］孫文基.天然藥物有效成分提取與分離［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1999：145-148.

［6］中華人民共和國藥典委員會.中國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：附錄，170-180.

［7］傅杰，李英華，呂秀陽.樣品預(yù)處理方法對蟲草頭孢菌粉中腺苷含量測定的影響［J］.江南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008（1）：28-30.

R284.2

A

1007－4813（2010）06－0952－03

2010－08－26）

鄭美娟（1975－），女，大學(xué)本科，講師。研究方向：中藥學(xué)。