枯草芽孢桿菌誘變株發(fā)酵羽毛工藝條件的研究

吉林工商學(xué)院 張 昕

禽類羽毛中含75%～85%的硬質(zhì)角蛋白，羽毛角蛋白中的氨基酸大部分為疏水性氨基酸，其中胱氨酸二硫鍵很難被蛋白質(zhì)水解酶打開(kāi)，使羽毛角蛋白性質(zhì)極其穩(wěn)定，在稀酸、稀堿溶液中不易水解，如果僅靠動(dòng)物自身消化道中的消化酶基本上無(wú)法將其消化吸收。因此，要利用家禽羽毛作飼料，必須經(jīng)過(guò)一定的處理。目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的羽毛加工方法有：酸（堿）水解法、高溫高壓水解法、膨化法、酶法?，F(xiàn)有的物理、化學(xué)加工方法效果不理想，直接加入酶制劑的方法成本太高。生物發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)在處于研究階段，在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道（蔡成崗和鄭曉冬，2006；吳小倫等，2001）。因此，筆者通過(guò)多年研究，對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變，篩選出產(chǎn)角蛋白酶活力強(qiáng)的誘變菌株FUN 30.2，本試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)生物降解羽毛粉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種 枯草芽孢桿菌紫外線和亞硝酸鈉復(fù)合誘變菌株FUN 30.2（實(shí)驗(yàn)室保留的誘變種）。

1.2 培養(yǎng)基 優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基成分：羽毛粉5.5%，青貯玉米秸稈粉0.8%，K+濃度0.018 mol/L，Mg2+濃度 0.065 mol/L，Ca2+濃度 0.072 mol/L，F(xiàn)e2+濃度 0.010 mol/L，Na+濃度 0.088 mol/L。 pH：7.0 ～8.0。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種培養(yǎng)及酶活力測(cè)定方法

2.1.1 菌種培養(yǎng)方法 培養(yǎng)18 h的斜面菌種轉(zhuǎn)接到50 mL牛肉膏-蛋白胨液體培養(yǎng)基中，（36±1）℃培養(yǎng) 18 h。

2.1.2 酶活力測(cè)定方法 發(fā)酵液過(guò)濾離心后，取其上清液 1 mL，加 2 mL Tris-HCl buffer（50 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0），然后加入 10 mg 羽毛粉，置于40℃水浴保溫振蕩反應(yīng)6 h，然后加入2 mL 10%TCA終止反應(yīng)。30 min后，4℃離心15 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為8000 r/min，上清液于280 nm處測(cè)定OD值。對(duì)照試驗(yàn)先加TCA終止液，其他試驗(yàn)過(guò)程同上（張寒俊等，2004）。

酶活力定義為：以試驗(yàn)組與對(duì)照組在280 nm處測(cè)定的吸光度OD值的差值表示，吸光度值每增加1所需的酶量為1 U。

羽毛角蛋白降解率=（加入羽毛粉干重-發(fā)酵后濾渣干重）/加入羽毛粉干重×100%。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶有影響的7因素16水平，以菌體產(chǎn)生的角蛋白酶 活力為響應(yīng)值，F(xiàn)e2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、青貯玉米秸稈粉和羽毛粉加入量為因變量，對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，采用U*16（1610）使用表設(shè)計(jì)和安排試驗(yàn)。

三角瓶中裝液量150 mL/500 mL，接種量5%， 搖床轉(zhuǎn)數(shù) 150 r/min，（36±1）℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，取上清液過(guò)濾離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為8000 r/min，4℃離心15 min取上清液測(cè)定酶活力。

2.3 菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗(yàn) 通過(guò)測(cè)定不同發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌誘變種產(chǎn)酶的酶活力來(lái)優(yōu)化發(fā)酵條件，為工業(yè)化生產(chǎn)生物降解羽毛粉提供工藝參數(shù)。

2.3.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 配制均勻設(shè)計(jì)的優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，分別在設(shè)定溫度的搖床里進(jìn)行發(fā)酵，其他發(fā)酵條件為，培養(yǎng)基裝液量150 mL/500 mL、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min發(fā)酵48 h，接種量為5%（V/V），發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定酶活力。

2.3.2 接種量的優(yōu)化 分別以設(shè)定的接種量，在優(yōu)化的溫度下發(fā)酵48 h后測(cè)定酶活力。

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 設(shè)定不同的搖床轉(zhuǎn)速，在上面試驗(yàn)中確定的溫度和接種量條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵48 h結(jié)束后分別測(cè)定酶活力。

2.3.4 發(fā)酵液裝液量的優(yōu)化 分別設(shè)定發(fā)酵液的裝液量，在前面試驗(yàn)確定的條件下發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酶活力。

2.3.5 發(fā)酵液初始pH值的優(yōu)化 初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響：配制完全培養(yǎng)基，把培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)到 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。其他發(fā)酵條件為優(yōu)化后的條件，24 h發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍，于660 nm測(cè)定吸光度值。

初始pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響：配制均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，把培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)到 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。 其他發(fā)酵條件為優(yōu)化后的條件，48 h發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定酶活力。

2.3.6 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：配制優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，設(shè)定不同培養(yǎng)時(shí)間，每隔6 h測(cè)定一瓶發(fā)酵液中活細(xì)胞數(shù)。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響：配制優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基，設(shè)定不同培養(yǎng)時(shí)間，每隔6 h測(cè)定一瓶發(fā)酵液的酶活力及羽毛降解率。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯微鏡觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 顯微鏡下觀察未降解羽毛粉

圖2 顯微鏡下觀察已降解羽毛粉

3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，條件（6）菌體產(chǎn)生的角蛋白酶活力高達(dá)1.117 U/mL，所以選擇優(yōu)化羽毛粉培養(yǎng)基成分配比為：羽毛粉5.5%，青貯玉米秸稈粉0.8%，K+濃度 0.018 mol/L，Mg2+濃度 0.065 mol/L，Ca2+濃度 0.072 mol/L，F(xiàn)e2+濃度 0.010 mol/L，Na+濃度0.088 mol/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基之前，測(cè)定菌體角蛋白酶活力為0.889 U/mL；培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌體產(chǎn)酶活力提高了25.65%。

表1 各因素水平的角蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

3.3 菌株發(fā)酵及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響

3.3.1 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，溫度為27～33℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力明顯提高，超過(guò)33℃以后，隨著溫度的升高酶活力下降。FUN 30.2菌株在33℃發(fā)酵，酶活最高達(dá)到了1.121 U/mL。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為33℃。比誘變前菌體生長(zhǎng)的適宜溫度略低。

3.3.2 接種量的優(yōu)化 見(jiàn)圖4。

圖4 接種量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酶活力的影響

由圖4可見(jiàn)，接種量對(duì)菌體降解角蛋白的能力影響不大，適當(dāng)增加接菌量，可以縮短發(fā)酵的適應(yīng)期，減少雜菌污染的幾率。接種量從2%增加到6%，酶活力呈上升趨勢(shì)，接種量從6%增加到9%，酶活力變化不明顯，因此確定接種量為6%。

3.3.3 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 見(jiàn)圖5。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響

由圖5可見(jiàn)，搖床轉(zhuǎn)速直接影響發(fā)酵液中的溶氧，搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?0 r/min升到170 r/min，酶活力隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高而明顯增加，超過(guò)170 r/min后，酶活力變化不大。確定搖床轉(zhuǎn)速170 r/min。

3.3.4 發(fā)酵液裝液量的優(yōu)化 見(jiàn)圖6。

圖6 裝液量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酶活力的影響

由圖6可見(jiàn)，裝液量加大，發(fā)酵液的酶活力明顯降低。裝液較多影響了發(fā)酵液中的溶氧，從而影響菌體的正常生長(zhǎng)。裝液量在100 mL時(shí)，發(fā)酵液酶活力最大。最大值為1.163 U/mL，確定最適合的裝液量為100 mL/500 mL。

3.3.5 發(fā)酵液初始pH值的優(yōu)化

3.3.5.1 初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響：見(jiàn)圖7。

圖7 發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

由圖7可見(jiàn)，菌體生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)基初始pH值范圍是6.5～7.5，最適pH值為7.0。

3.3.5.2 初始pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響：見(jiàn)圖8。

圖8 發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶活力的影響

由圖8可見(jiàn)，pH值為5.5～7.5時(shí)，酶活力迅速增大，pH值為7.5時(shí)酶活力達(dá)到高峰，pH值大于8.0時(shí)，酶活力逐漸下降，選擇菌體產(chǎn)酶的發(fā)酵液最適宜pH值為7.5～8.0。

3.3.6 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 見(jiàn)圖9。

圖9 發(fā)酵液中的活細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

由圖9可見(jiàn)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：培養(yǎng)時(shí)間0～18 h，菌體處于適應(yīng)期，培養(yǎng)時(shí)間18～36 h，菌體處于對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)時(shí)間36～54 h，菌體處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)時(shí)間54 h后，菌體處于衰亡期。從菌體的生長(zhǎng)曲線分析，在以羽毛和玉米秸稈為碳、氮源的培養(yǎng)基中，菌體的適應(yīng)期較長(zhǎng)，可能是細(xì)胞進(jìn)行代謝的調(diào)整，包括誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生，據(jù)資料報(bào)道，角蛋白酶是誘導(dǎo)酶，這可能與菌體的適應(yīng)期較長(zhǎng)有關(guān)。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)酶活力的影響：由圖10可見(jiàn)，每隔6 h測(cè)定一瓶?jī)?yōu)化羽毛粉發(fā)酵液的酶活力及羽毛降解率。發(fā)酵時(shí)間從0～60 h，菌體的酶活力不斷上升，其中24～60 h菌體酶活力的提高較快，60 h菌體酶活力最高達(dá)1.267 U/mL；60 h以后酶活力迅速下降，90 h以后酶活力略有回升趨勢(shì)，可能與菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵液的pH值變化有關(guān)。同時(shí)，羽毛降解率在持續(xù)上升，36～72 h階段羽毛降解率上升較快，72 h降解率已經(jīng)達(dá)到了69.61%，72 h以后降解率變化不明顯。綜合分析發(fā)酵過(guò)程中酶活力和羽毛降解率的變化規(guī)律，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力和羽毛降解率的影響

3.4 發(fā)酵液氨基酸含量測(cè)定 由吉林大學(xué)測(cè)試中心測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 羽毛粉發(fā)酵液的氨基酸含量測(cè)定結(jié)果mg/mL

4 結(jié)論

4.1 羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株最佳羽毛培養(yǎng)基成分配比為：羽毛粉5.5%，青貯玉米秸稈粉 0.8%，K+濃度 0.018 mol/L，Mg2+濃度0.065 mol/L，Ca2+濃 度 0.072 mol/L，F(xiàn)e2+濃 度0.010 mol/L，Na+濃度 0.088 mol/L。培養(yǎng)基優(yōu)化后，菌體產(chǎn)酶活力提高了25.65%。

4.2 應(yīng)用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)影響菌株發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h，搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，接種量 6%，裝液量 100 mL/500 mL，菌體生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)基初始pH值范圍是7.0左右，菌體產(chǎn)酶的發(fā)酵液最適宜pH值為7.5～8.0。在培養(yǎng)時(shí)間因素試驗(yàn)中，發(fā)酵液中活細(xì)胞數(shù)在48 h達(dá)到高峰，為3.9×109CFU/mL；60 h菌體產(chǎn)酶活力最高達(dá)1.267 U/mL；在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72 h時(shí)，羽毛降解率達(dá)到了69.61%。

3.5.3 經(jīng)該菌株發(fā)酵，羽毛角蛋白大量轉(zhuǎn)化為氨基酸、短肽和菌體蛋白，發(fā)酵液的氨基酸含量高達(dá)22.66 mg/mL。

[1]蔡成崗，鄭曉冬.角蛋白酶的來(lái)源、理化性質(zhì)與生物工程研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（4）：111 ～ 113.

[2]吳小倫，閔航，馬曉航.羽毛角蛋白的生物降解 [J].環(huán)境污染與防治2001，23（1）：66 ～ 68.

[3]張寒俊，劉大川，楊國(guó)燕.紫外光譜法定量測(cè)定不同種蛋白酶活力的研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2004，9：44 ～ 45.