從血液流變學的改變分析腎上腺素致血瘀證大鼠模型的建立1)

趙 玲,魏海峰,李雅莉,張 麗,李 林

血瘀證即指人體內血脈不暢,血行遲緩澀滯,血液壅阻血脈或離經停積的病理生理狀態,是目前臨床上最常見的癥候之一,可見于多種疾病的發生發展過程中。血瘀證及活血化瘀療法是近代中西醫結合研究中最活躍的領域之一,其中關于血瘀證動物模型的研制也取得很大的進展。

七情中的“憂怒”為血瘀證常見病因之一,中醫認為:“氣為血之帥”,氣行則血行,氣止則血止。肝主疏泄,司調暢氣機。如果肝氣郁結,氣機阻滯,則血行不暢,而致血瘀。中醫所謂的“肝郁”是指由于高級神經活動紊亂而表現的癥候群,其主要病因是情志異常。情志異常可引起機體調控功能失調,內環境失平衡,氣血失和,而致經脈瘀阻。在氣滯的病理過程中往往存在著交感神經系統調控異常,血液中兒茶酚胺類激素含量升高。因此,在以往研究中多采用兒茶酚胺類激素如腎上腺素進行血瘀證的造模。目前常用的腎上腺素短期給藥復合冰水應激的建立血瘀證大鼠模型的造模方式,是一種急性的應激狀態,難以體現中醫血瘀證中緩慢的由氣機郁滯到血瘀的動態時空的變化過程。本研究采用長期小劑量注射腎上腺素的方法,與以往常用的腎上腺素急性給藥復合冰水應激的造模方法相比較,觀察這種大鼠模型的血液流變學改變特征。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠,體重240 g～280 g,SPF級,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證號:SCXK-11-00-0008。

1.2 試劑與儀器 鹽酸腎上腺素注射液(Adr),1 mg/m L,由天津金耀氨基酸有限公司提供,國藥準字H 12020526;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone,PVP),Sigma公司產品;F-8018纖維蛋白原(FIB)測定試劑盒,由美德太平洋科學集團提供。LBY-N6B全自動清洗血流變儀及微量血漿測試裝置,LBY-BX3紅細胞變形儀,C2000-2高性能血凝儀,均由北京普利生儀器有限公司提供。DL-4000B冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠生產。

1.3 模型建立及分組 大鼠隨機分為6組。空白對照組:與實驗組同批同條件飼養,但不注射Ad r,不以冰水浸泡。急瘀1 d組:Ad r 1.8mg/(kg?d),分兩次皮下注射,兩次間隔4 h;在兩次注射Adr之間,將大鼠浸入冰水中5 min,實驗進行1 d。急瘀2 d組:動物處理與急瘀1 d組相同,但實驗進行2 d。慢瘀小劑量組:Ad r 0.1mg/(kg?d),分兩次注射,持續7 d;不浸泡冰水。慢瘀中劑量組:A dr 0.3 mg/(kg?d),其余同慢瘀小劑量組。慢瘀大劑量組:Adr 0.9 mg/(kg?d),其余同慢瘀小劑量組。各組動物均在最后一次注射Ad r后24 h處死。

1.4 測定指標與方法 大鼠禁食8 h后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉3mg/kg麻醉,頸總動脈抽血。

1.4.1 血液黏度測定 取肝素抗凝血0.8m L,用LBY-N 6B全自動血液流變儀,測定全血黏度。以肝素抗凝血1 m L,3 000 r/m in離心10m in,取上清0.2 m L血漿以微量血漿測試裝置檢測血漿黏度。

1.4.2 紅細胞變形指數、聚集指數測定 取肝素抗凝血0.15 m L,加15%PVP緩沖液2 m L,混勻;取0.5 m L樣品,然后用LBY-BX 3紅細胞變形儀,測定在切變率600 s-1、800 s-1、1 000 s-1下的紅細胞變形指數。以肝素抗凝血0.4m L,加15%PVP緩沖液0.1 m L,混勻;取0.5 m L樣品,然后用LBY-BX3紅細胞變形儀測定紅細胞聚集指數。

1.4.3 血漿纖維蛋白原含量測定 取枸櫞酸鈉抗凝血,3 000 r/m in離心10 min,取上清(血漿)以FIB緩沖液稀釋(1∶9),取稀釋液0.1 m L放于測試杯中,37℃溫育5 min,加入FIB試劑0.05m L,在C2000-2高性能血凝儀測定FIB含量。

2 結 果

2.1 不同給藥方式、不同濃度腎上腺素對大鼠血液黏度、血漿纖維蛋白原的影響(見表1) 小、中劑量腎上腺素連續皮下注射7 d,可引起大鼠低、中、高切變率下全血黏度、血漿纖維蛋白原明顯升高(P＜0.05或P＜0.01),對血漿黏度無明顯影響。而高劑量腎上腺素注射7 d對全血黏度及血漿黏度均無明顯影響。超大劑量腎上腺素(1.8 mg/kg)皮下注射加冰水浸泡5 m in處理1 d或2 d,均可見血漿黏度、血漿纖維蛋白原明顯升高(P＜0.01);處理1 d組可見低切變率下全血黏度的升高(P＜0.05),而對高、中切變率下全血黏度無明顯影響。

表1 腎上腺素致瘀大鼠模型血液黏度的變化(±s)

表1 腎上腺素致瘀大鼠模型血液黏度的變化(±s)

組別n 全血黏度(m Ps?s)10 s-1 60 s-1 150 s-1血漿黏度mPa?s FIB g/L對照組9 12.47±1.90 7.09±0.60 5.26±0.35 0.92±0.02 1.47±0.32急瘀1 d組7 15.17±2.451)7.67±0.79 5.58±0.56 1.05±0.052)3.67±0.212)急瘀2 d組6 14.60±1.67 7.24±0.64 5.31±0.28 1.00±0.052)3.36±0.212)慢瘀小劑量組10 15.71±2.702)8.70±0.862)6.43±0.492)0.91±0.07 2.17±0.282)慢瘀中劑量組9 15.22±2.541)8.26±1.022)6.04±0.562)0.96±0.02 2.35±0.412)慢瘀大劑量組8 12.68±2.71 7.21±0.80 5.30±0.42 0.94±0.03 2.35±0.412)與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 不同給藥方式、不同濃度腎上腺素對大鼠紅細胞變形性及聚集性的影響(見表2) 大劑量腎上腺素(0.9 mg/kg)連續注射7 d,能引起紅細胞變形指數明顯降低(P＜0.05)。超大劑量腎上腺素(1.8mg/kg)注射加冰水浸泡處理2 d也可見紅細胞變形指數的降低(P＜0.05)。但不同給藥方式、不同劑量腎上腺素造模,對大鼠紅細胞聚集指數均無明顯影響。

表2 腎上腺素致瘀大鼠紅細胞變形指數及聚集指數的變化(±s)

表2 腎上腺素致瘀大鼠紅細胞變形指數及聚集指數的變化(±s)

組別n 紅細胞變形指數(%)600 s-1 800 s-1 1 000 s-1紅細胞聚集指數%對照組9 49.13±1.83 51.74±1.87 52.88±1.96 44.59±8.64急瘀1 d組7 48.77±1.59 51.50±1.36 52.70±1.24 45.76±6.15急瘀2 d組6 46.65±1.481)49.75±1.301)51.07±1.201)47.75±6.81慢瘀小劑量組10 49.12±1.69 51.83±1.61 53.08±1.56 46.66±7.18慢瘀中劑量組9 48.38±2.49 50.78±1.89 52.07±1.87 49.87±6.34慢瘀大劑量組8 46.85±2.321)49.64±2.181)50.91±2.131)47.02±4.85與對照組比較,1)P＜0.05

3 討 論

氣機郁滯是中醫血瘀證的主要成因之一。其中,氣郁和氣滯分別體現了中醫氣機不暢的不同程度。氣郁多為慢性起病,常由情志不舒,氣機宣而不暢,日久成郁,無力推動血行,發為血瘀,是一個兒茶酚胺類激素緩慢升高的過程,充分體現了中醫動態時空的特征。氣滯常為急性起病,常由暴怒、大怒,導致氣機阻滯不暢,氣滯則血瘀,是一個兒茶酚胺類激素急劇升高的過程,體現了應激的過程。二者病因不同,所引發的血瘀證的程度也不盡相同。根據中西醫結合醫學的論述,血瘀證主要是由于血液的流動性和黏度變化所致[1]。近年來,研究表明,大劑量腎上腺素皮下給藥加冰水應激可以引起血液黏度增高等血液流變學變化[2]和血管內皮損傷[3],關于大劑量腎上腺素加冷刺激快速造成血瘀模型的方法已經被廣泛使用,在造模方法的規范上也進行了一些探索性研究,包括腎上腺素的造模濃度[4]和造模周期[5]等,提出了腎上腺素長期小劑量造模的方法,證明了腎上腺素長期給藥,可以引起血液流變學的改變和血管內皮損傷[6]等變化。但沒有結合中醫理論加以闡明。本研究以大鼠為觀察對象,研究了兩種病因所引起的血液流變學指標的變化情況。采用腎上腺素的3個劑量和大劑量腎上腺素結合冰水應激的方法進行比較造模,驗證了氣郁血瘀和氣滯血瘀的理論,也說明了機體腎上腺素增多是血瘀證的主要成因之一。

本研究所采用的小劑量腎上腺素長期注射法,是模擬中醫氣郁血瘀的理論,通過小劑量腎上腺素持續興奮交感神經,引發肝氣郁結,無力推動血行,久之成瘀。采用的大劑量腎上腺素結合冰水浸泡的造模方法,是模擬中醫氣滯血瘀的理論,通過暴怒時機體釋放大劑量的腎上腺素,佐以冰水應激,引發肝氣郁滯,氣滯無力推動血行,發為急性血瘀。結果發現腎上腺素0.1 mg/kg和0.3 mg/kg連續注射7 d,可以引起大鼠全血黏度和纖維蛋白原含量明顯升高。腎上腺素0.9mg/kg連續注射7 d,能引起紅細胞變形指數的明顯降低,纖維蛋白原含量明顯升高;而對全血黏度無明顯影響。腎上腺素1.8 mg/kg注射加冰水浸泡處理1 d或2 d,均可見血漿黏度和纖維蛋白原明顯升高;急瘀2 d組還可見紅細胞變形指數的降低;急瘀1 d組可引起低切全血黏度的升高,而對高切、中切全血黏度及紅細胞聚集指數無明顯影響。

本研究結果顯示,小、中劑量腎上腺素連續注射,主要是引起全血黏度和纖維蛋白原的改變,大劑量腎上腺素連續注射,主要是引起紅細胞變形指數和纖維蛋白原含量的改變。超大劑量腎上腺素給藥加冰水應激處理1 d,主要是引起血漿黏度、纖維蛋白原和全血黏度的改變,處理2 d主要是引起血漿黏度、纖維蛋白原和紅細胞變形指數的改變。本研究中血液流變學指標變化的差異,可能與腎上腺素不同劑量和不同給藥方式所引起的機體反應不同有關。腎上腺素給藥量相對小并以慢性給藥,主要是引起全血黏度的變化,提示全血黏度的改變是一個慢性過程,是氣郁引發的血瘀特征。腎上腺素給藥量相對大,主要是引起紅細胞變形指數的改變,提示紅細胞變形能力的變化需要大劑量腎上腺素的作用,說明氣滯時大劑量腎上腺素釋放,是引起血管收縮,導致紅細胞變形能力差、血液瘀滯的主要原因。腎上腺素急性給藥加冰水應激,主要是引起血漿黏度的變化,說明血漿黏度的改變是一個急性應激的變化過程,是氣滯血瘀的表現。

全血黏度、紅細胞變形指數和血漿FIB含量是血液流變學改變的代表指標。本研究結果表明,不同劑量與不同給藥方式的腎上腺素都可引起血液流變學的部分改變。其中腎上腺素0.3 mg/kg連續注射7 d(慢瘀中劑量組)引起大鼠全血黏度升高、血漿FIB含量增加、紅細胞變形性有降低的趨勢、紅細胞聚集性有升高的趨勢,體現了血瘀證從血漿到全血到紅細胞功能的動態時空特征,是較能體現中醫氣郁血瘀證特征的較好的造模方法。腎上腺素注射1.8mg/(kg?d)加冰水浸泡5m in,實驗進行2 d引起大鼠血漿黏度升高、血漿FIB含量增加、紅細胞變形性降低,可作為氣滯血瘀證動物模型。

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