含溶栓顆粒血清對TNF-α損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞VEGF的影響1)

臧運華,唐 明,郭瑞友,葉俊麗,曹曉嵐

腦缺血是一種腦循環(huán)血流量下降為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是當今疾病中主要致殘、致死原因之一。近年來研究表明,內(nèi)皮細胞不僅是機械性防御結構,而且是體內(nèi)最大的“內(nèi)分泌器官”,可以生成血管活性物質(zhì),參與血流動力學、血管通透性的調(diào)節(jié),在血栓形成、脂質(zhì)沉積、細胞黏附等方面均有重要作用。

溶栓顆粒(枳實、柴胡、地龍、水蛭等組方)是在臨床治療缺血性中風病的有效方劑。前期研究發(fā)現(xiàn)溶栓顆粒對大鼠缺血再灌注損傷有一定保護作用。本研究旨在觀察溶栓顆粒對血管內(nèi)皮細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量250 g～280 g,購自青島市藥檢所實驗動物中心。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),購自北方偉業(yè)科技有限公司。DM EM培養(yǎng)液和胎牛血清、胰酶(1∶250)(美國GIBCO公司);Ⅰ型膠原酶、L谷氨(美國Gibco公司)。VEGF免疫組化試劑盒,購自武漢博士德科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購自上海天呈生物信息科技有限公司。溶栓顆粒由枳實、柴胡、地龍、水蛭等組成,每包14 g(含生藥64 g)由青島市海慈醫(yī)療集團制劑實驗室提供。

1.2 含藥血清制備 Wistar大鼠20只(雄性),隨機分為空白組、中藥大劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組。空白組灌胃蒸餾水,中藥大、中、小劑量組分別予0.2 g/L、0.1 g/L、0.05 g/L溶栓顆粒2m L灌胃,共灌胃3 d,于最后1次給藥后分別于1 h、1.5 h、2 h無菌條件下腹主動脈取血,離心分離血清,不同時間取同一組血清混合后經(jīng)56℃、30 min滅活,用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鹘M含藥血清為:正常血清、大劑量中藥血清、中劑量中藥血清、小劑量中藥血清。

1.3 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株的培養(yǎng) HUVEC用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置孵箱(37℃,5%CO2)培養(yǎng)。鏡下細胞計數(shù),待細胞達對數(shù)增長期,實驗共分6組,接種于24孔培養(yǎng)板,接種密度3×104/m L,為空白組、模型組、正常血清組、大劑量中藥組、中劑量中藥組、小劑量中藥組。分組后置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育,除空白組外各組加入TNF-α40 ng/m L孵育6 h,用含藥血清處理24 h后檢測。空白組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液;模型組:人HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育。正常血清組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加正常血清。大劑量中藥組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加大劑量中藥血清。中劑量中藥組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加中劑量中藥血清。小劑量中藥組:HUVEC加DM EM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加小劑量中藥血清。

1.4 培養(yǎng)細胞VEGF檢測 按照免疫組化試劑盒說明進行。培養(yǎng)細胞形態(tài)觀察采用HE染色,光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用PEMS 3.1統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,采用方差分析和t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 形態(tài)學觀察 模型組、正常血清組HUVEC細胞數(shù)量下降,皺縮、變形,分裂相細胞明顯增加,細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化:血管內(nèi)皮細胞部分呈明顯的長梭形、星形,似成纖維細胞樣改變,細胞間隙增大。中藥大、中、小劑量組細胞密度大于模型組及正常血清組,分裂相細胞少于模型組及正常血清組。每組各觀察10個放大200倍光鏡下視野所記錄的有絲分裂細胞數(shù)。詳見表1。

表1 各組有絲分裂細胞數(shù)比較

2.2 VEGF蛋白表達 胞漿內(nèi)棕黃色顆粒的是陽性細胞。空白組HUVEC細胞漿內(nèi)沒有或有少量棕黃色顆粒,染色很淺。模型組、正常血清組HUVEC有較多細胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒,染色較深。大、中、小劑量中藥組胞漿含黃色顆粒細胞較少,染色較淺。表明空白組不表達VEGF蛋白,模型組、正常血清組及大、中、小劑量中藥組有VEGF蛋白表達,各劑量中藥可減少VEGF蛋白表達。各組10×40倍光鏡下計數(shù)10個視野,計算陽性細胞數(shù)量。詳見表2。

表2 各組VEGF蛋白表達陽性細胞數(shù)量比較

3 討 論

近年來研究表明,內(nèi)皮細胞不僅是機械性防御結構,而且是體內(nèi)最大的“內(nèi)分泌器官”,可以生成血管活性物質(zhì),參與血流動力學、血管通透性的調(diào)節(jié),在血栓形成、脂質(zhì)沉積、細胞黏附等方面均有重要作用。隨著對細胞因子網(wǎng)絡研究的不斷深入,已證實內(nèi)皮細胞還具有產(chǎn)生細胞因子的作用,可通過旁分泌或自分泌形式在其生成的微環(huán)境中直接發(fā)揮作用,或進入循環(huán)系統(tǒng),引起全身效應[1]。

前期研究發(fā)現(xiàn),溶栓顆粒腦保護作用可能存在以下機制:抑制由白介素-1β(IL-1β)介導的急性炎癥反應;抑制白細胞黏附鏈條式過程中的IL-1β和細胞黏附分子-1(ICAM-1)產(chǎn)生環(huán)節(jié),從而減少白細胞黏附造成的腦組織損傷[2];降低丙二醛(MDA)的過量釋放、提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強抗脂質(zhì)過氧化能力;降低TNF-α的過量釋放、減少腦含水量[3];抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達,從而減少由MMP-9所造成的血腦屏障通透性增加和腦水腫及對腦組織的直接損傷[4]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管內(nèi)皮細胞特異性的促有絲分裂原,屬分泌性糖蛋白,具有促進內(nèi)皮細胞增殖、加速新血管形成,增強血管通透性等作用[5]。血管內(nèi)皮細胞正常時不表達VEGF,但在血管內(nèi)皮細胞被置于缺氧環(huán)境時細胞內(nèi)VEGF明顯增加。

炎癥因子可一定程度地促進VEGF在內(nèi)皮細胞中的表達。炎癥因子對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響是一個多因素調(diào)控的復雜過程,本研究顯示TNF-α增加VEGF表達,可能是動脈粥樣硬化發(fā)展的機制之一。在TNF-α損傷狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細胞生長因子表達增加,血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖增加,加快動脈粥樣硬化斑塊形成,增加動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性。這可能是炎性介質(zhì)誘發(fā)動脈粥樣硬化形成以及破裂的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn),溶栓顆粒對HUVEC有保護作用,能夠減少TNF-α對內(nèi)皮細胞的損害。溶栓顆粒的這一作用可能由于減少VEGF的表達而實現(xiàn)。其中,大劑量和中劑量溶栓顆粒效果較明顯,而小劑量中藥組并未顯示出明顯的降低VEGF表達作用。小劑量中藥組以及正常血清組相對于不加入大鼠血清的模型組有減少趨勢,抑制VEGF表達的作用相當,考慮或許單純增加血清含量也能減少VEGF表達,其具體機制有待于進一步研究。

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