小鼠腦缺血再灌注后地塞米松對海馬CA 1區神經細胞形態學的影響

邢春平,趙嘉訓

低循環灌注(不完全性缺血)或循環停止(完全性缺血)后再灌注腦損傷為臨床急救復蘇中經常面臨的問題。糖皮質激素因其減輕炎癥反應、改善腦水腫和清除自由基等作用,常被用于臨床腦保護和腦復蘇,但其在再灌注損傷后的治療效果究竟如何,臨床目前還未見到隨機、前瞻性的比較研究報道。激素在缺血性腦血管病中的應用一直是腦血管病治療中頗有爭議的問題。20世紀90年代有學者[1]認為糖皮質激素有減輕缺血性腦損傷的作用,后來也有人[2]認為藥理劑量的糖皮質激素可加重缺血性腦損傷,對腦缺血再灌注損傷后糖皮質激素的治療作用研究報道更少。關于給藥時間,文獻報道中多為預先給藥,與臨床實際差距較大。本研究采用雙側頸總動脈阻斷法[3]制造大鼠前腦缺血模型,擬從神經病理學的角度觀察大劑量地塞米松對小鼠腦缺血再灌注損傷后早期用藥的作用,以觀察海馬CA1區病理改變,其中主要以觀察神經元細胞的病理變化,明確地塞米松對改善腦缺血再灌注的效果。從而為臨床提供確實可靠的證據以及新的治療方法,就雙側頸總動脈阻斷法而言,較單側大腦中動脈阻斷法更具臨床價值[4,5],更接近于臨床。所以本研究具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 動物 健康昆明小鼠54只,雌雄各半,體質量20 g±2 g,由山西省腫瘤研究所動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 按隨機數字表將小鼠分為9組,每組6只,假手術組(I):僅游離雙側頸總動脈;生理鹽水對照4組(N1,N2,N3,N4):絲線結扎雙側頸總動脈,1 h后松開,再灌注0 h、0.5 h、1 h、1.5 h后經尾靜脈分別給予相當量的生理鹽水;地塞米松干預4組(D1,D2,D3,D4):絲線結扎雙側頸總動脈,缺血1 h后松開,再灌注0 h、0.5 h、1 h、1.5 h后經尾靜脈分別給予地塞米松10 mg/kg。以上9組均采取再灌注24 h后斷頭取腦。

1.2.2 模型及病理標本的制備 在室溫25℃、濕度50%的條件下進行腦缺血再灌注手術,用0.6%的戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射后,將小鼠仰臥位固定,彎剪去毛,作頸部正中切口約1 cm,鈍性分離下頜下腺,將其向上翻起,暴露胸鎖乳突肌,在其后內側,氣管后外側,分離兩側頸總動脈,穿3-0絲線備用,輕輕提拉備用線,用絲線打活結結扎雙側頸總動脈將其阻斷,即為缺血開始,達到1 h后,松開線結即為再灌注開始。用慶大霉素沖洗術野,3-0絲線縫皮,置清潔飼養籠中觀察,并分別行各個時間段地塞米松及生理鹽水尾靜脈注射。24 h后苯巴比妥鈉腹腔麻醉,依次以溫生理鹽水,40 g/L多聚甲醛進行左心室灌注,然后迅速斷頭取腦,繼續用中性甲醛溶液固定24 h,取視交叉到乳頭體后部之間的腦組織,然后進行常規脫水,浸蠟,透明,包埋,切片厚度5μm,每腦取相當于前囟點(Bregma點)-2.12mm,-2.56 mm平面片2張,行H E染色。在有測微尺顯微鏡(×10)的光鏡下,計數海馬CA 1區2 mm范圍內核完整的錐體細胞數(自CA 1區始點起)。

1.2.3 模型制備標準 在結扎小鼠雙側頸總動脈后,以出現驚厥、呼吸深慢、心跳加快為成功標準[6]。

2 結 果

2.1 動物模型的評價 雙側頸總動脈阻斷后,用于再灌注觀察的小鼠,于麻醉清醒后出現了輕重不同的神經功能缺損癥狀。進行蘇木精-伊紅染色的大鼠腦片均出現了輕重不等的神經細胞變性改變。

2.2 形態學結果 腦缺血再灌注后腦組織形態學改變。假手術組海馬各區神經細胞結構正常,海馬CA 1區錐體細胞呈橢圓形,核染色質稀疏,核仁清楚;生理鹽水組海馬組織學圖片,細胞數量明顯下降,變性細胞數明顯增多,可見許多神經元出現明顯形狀上的改變,細胞形態不規則,細胞體積縮小,胞漿濃縮,染色質凝集,嗜酸色染色增強。缺血再灌注地塞米松組病變神經元數較假手術組明顯減少。

2.3 各組海馬CA 1區2 mm范圍內核完整的正常錐體細胞數(見表1)

表1 各組小鼠海馬CA 1區2 mm正常錐體細胞數(±s)

表1 各組小鼠海馬CA 1區2 mm正常錐體細胞數(±s)

組別n正常錐體細胞數(個)I 12 23.080±3.147 12 12.420±2.353 D1 12 22.583±2.429 D2 12 20.917±1.975 D3 12 18.917±1.564 D4 12 18.250±1.357 N

3 討 論

糖皮質激素被廣泛應用于缺血性腦血管病的治療,地塞米松是經典的合成類糖皮質激素,具有代表性。關于給藥時間,文獻報道中多為預先給藥,與臨床實際差距較大。本研究采取再灌注后給藥,而且采取大劑量地塞米松(10 mg/kg)經尾靜脈不同時間點注射,頗具臨床價值。從數據與統計結果來看,地塞米松組明顯較生理鹽水組正常細胞數多,變性細胞數少;地塞米松4組,隨用藥時間點的推移,正常細胞數逐漸減少,變性細胞數逐漸增多。

大劑量地塞米松在腦缺血再灌注早期用藥療效明顯,而且用藥越早療效越好。此結論也為臨床用藥提供了有力的證據。

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[4] 盧曉梅,金玉梅.燈盞花素對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響[J].錦州醫學院學報,2006,27(1):44-46.

[5] 趙紅,張海鵬.高壓氧對腦缺血再灌注小鼠血腦屏障通透性的影響[D].沈陽:中國醫科大學博士學位論文,2003.

[6] 王偉斌,樊敬峰.喜得鎮對腦缺血再灌注小鼠的行為及海馬興奮性氨基酸受體表達的影響[J].臨床神經病學雜志,2005,18(3):193-196.