Humanin對缺氧誘導的大鼠皮層神經元損傷的保護作用1)

趙珅婷,趙 麗,喬健天,張 策

Humanin(HN)是一種由24個氨基酸組成的線性多肽,是由日本科學家在老年癡呆(AD)患者腦內未受損的腦區發現的。HN最初被認為是一種針對老年癡呆相關損傷的特異性保護因子。然而,資料表明HN對缺血引起的PC12的細胞死亡也具有保護作用。提示HN可能不僅僅是一種特異性的神經保護因子,它可能具有更廣泛的神經保護作用。本實驗旨在觀察HN對缺氧引起的皮層神經元的損傷是否具有保護作用,進一步核實HN是否具有廣譜的神經保護作用。

1 材料方法

1.1 材料 健康Sprague-Daw ley(SD)大鼠由山西醫科大學動物中心提供。DMEM培養基、胎牛血清、D-Hank's平衡液購于Gibco-BRL(Carlsbad,CA,USA)。谷氨酰胺、MTT、Calcein-AM和Humanin購于Sigma Chemical Co.(St Louis,MO,USA)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于中國南京建成生物公司。全自動酶標儀(Elx800,基因公司,廣州),熒光顯微鏡(OLMPUS,Tokyo,日本)。

1.2 方法

1.2.1 原代皮層神經元培養 無菌分離1 d～3 d大鼠額前皮層,無菌手術剪刀剪碎,0.125%胰蛋白酶消化10 m in,機械吹打至均勻分散。滅活胎牛血清(FBS)終止消化,0.22μm濾器過濾。800 g離心5m in后棄上清,用含10%FBS,4mmol/L谷氨酸,4.5 g/L D-葡萄糖和100 U的青霉素的DMEM/Ham's F12培養基稀釋沉淀。將細胞種植在提前包被多聚賴氨酸的培養皿上。置于37℃,5%CO2孵箱中進行培養。培養24 h后加入阿糖胞苷阻止膠質細胞分裂。通過相差顯微鏡進行細胞生長狀態的觀察。培養10 d后取生長良好的細胞進行實驗。

1.2.2 神經元鑒定 培養10 d的細胞用4%甲醛固定20m in。PBS洗3次,每次5 min。用0.4%Triton配制的5%BSA室溫封閉1 h,PBS洗3次,每次5m in;抗MAP2一抗(1∶1 000)37℃2 h,PBS洗3次,每次5 m in;生物素化的二抗(1∶200)室溫1 h,PBS洗3次,每次5 m in;Cy3孵育37℃2 h,PBS洗3次,每次5min。用O lympusBX 40顯微鏡進行觀察,圖片用IPP 4.5軟件進行處理。

1.2.3 缺氧分組和HN處理 取培養10 d狀態良好的神經元,對照組繼續正常培養4 h,缺氧組置于缺氧孵箱內(氧含量＜2%)4h。藥物組分別于缺氧前24h加入終濃度為10μmo l/L和20μmol/L的HN。

1.2.4 MDA、SOD、LDH測定 依據南京建成生物公司試劑盒的說明書操作。

1.2.5 M TT測定 細胞種植于96孔板上。缺氧實驗后每孔加入20μL 0.5 mg/m L MTT孵育4 h。棄上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床上放置10 m in。全自動酶標儀490 nm波長進行吸光度測定。細胞存活計算公式如下:(實驗組吸光度-空白對照組吸光度)/(對照組吸光度-空白對照組吸光度)×100%。

1.2.6 Calcein-AM染色 Calcein-AM可以作為一種活細胞的熒光探針。缺氧后加入終濃度為20μmo l/L Calcein-AM 37℃孵育30 m in。D-Hank's平衡液沖洗3次,每次5 m in。使用OLMPUS熒光顯微鏡進行觀察。

2 結 果

2.1 神經元鑒定 細胞種植到培養皿上4 h～5 h后即可觀察到軸突生長。3 d后觀察胞體呈橢圓形或三角形,飽滿有光暈。可以看到單極或雙極神經元。10 d后觀察細胞成熟,突觸生長良好,相互之間形成網絡狀。MAP-Cy3免疫組化顯示神經元數目可以達到95%。

2.2 HN提高缺氧引起的細胞活力下降

2.2.1 MTT法檢測(見表1) 以對照組為100%計算,缺氧4 h可以引起細胞活性由100%降低到86.64%(P＜0.05),缺氧前24 h加入10μmol/L HN可以保護細胞活性恢復至94.13%(P＜0.05),而缺氧前24 h加入20μmol/L HN可以保護細胞活性恢復至97.10%(P＜0.05)。

表1 不同濃度HN對缺氧誘導神經元死亡的保護作用(±s)

表1 不同濃度HN對缺氧誘導神經元死亡的保護作用(±s)

組別n細胞活性(%)對照組6 100.00±0.00缺氧組6 86.64±2.821)10μmol/L HN+缺氧組6 94.13±2.712)20μmol/L HN+缺氧組6 97.10±2.842)與對照組比較,1)P＜0.05;與缺氧組比較,2)P＜0.05

2.2.2 Calcein-AM染色 缺氧4 h后可以看到細胞的熒光活性明顯降低,并且可以看到有很多細胞碎片。缺氧前24 h加入10μmo l/L HN可以看到細胞熒光活性有了明顯改善,而缺氧前24 h加入20μmo l/L HN可以使細胞的熒光活性基本上恢復到正常水平。

2.3 HN抑制缺氧引起的細胞損傷

2.3.1 LDH檢測 缺氧4 h可以使細胞和培養基中LDH水平分別上升1.56倍和2.17倍(P＜0.05)。缺氧前24 h加入10μmol/L HN可以使細胞和培養基中的LDH水平分別降低1.35倍和1.50倍(P＜0.05)。缺氧前24 h加入20μmol/L HN具有更明顯的效果,可以使細胞和培養基中的LDH水平分別降低了1.07倍和1.37倍(P＜0.05)。

表2 不同濃度HN對缺氧后細胞和培養基中LDH的影響(±s)

表2 不同濃度HN對缺氧后細胞和培養基中LDH的影響(±s)

組別n LDH(倍)細胞培養基對照組6 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧組6 1.56±0.061)2.17±0.031)10μmol/L HN+缺氧組6 1.35±0.042)1.50±0.042)20μmol/L HN+缺氧組6 1.07±0.092)1.37±0.022)與對照組比較,1)P＜0.05;與缺氧組比較,2)P＜0.05

2.3.2 MDA檢測(見表3) 缺氧4 h可以使細胞和培養基中MDA的生成分別上升1.83倍和1.69倍(P＜0.05)。缺氧前24 h加入10μmo l/L HN可以使細胞中MDA的生成降低1.52倍(P＜0.05),可以使培養基中MDA的生成降低1.65倍,但差異無統計學意義(P＞0.05)。缺氧前24 h加入20μmol/L HN具有顯著的抑制作用,可以使細胞和培養基中的LDH水平分別降低1.04倍和1.37倍(P＜0.05)。

表3 不同濃度HN對缺氧后細胞和培養基中MDA的影響(±s)

表3 不同濃度HN對缺氧后細胞和培養基中MDA的影響(±s)

組別n MDA(倍)細胞培養基對照組6 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧組6 1.83±0.021)1.69±0.031)10μm HN+缺氧組6 1.52±0.012)1.65±0.01 20μm HN+缺氧組6 1.04±0.012)1.28±0.032)與對照組比較,1)P＜0.05;與缺氧組比較,2)P＜0.05

2.3.3 SOD檢測(見表4) 缺氧4 h可以使細胞和培養基中SOD活性分別上升1.22倍和1.29倍(P＜0.05)。缺氧前24 h加入10μmo l/LHN可以使細胞中SOD活性降低1.0 3倍(P＜0.05),可以使培養基中MDA的生成降低1.25倍,但差異無統計學意義(P＞0.05)。缺氧前24h加入20μmol/LHN可以使細胞和培養基中的SOD水平進一步分別降低0.98倍和1.08倍(P＜0.05)。

表4 不同濃度HN對缺氧后細胞和培養基中SOD的影響(±s)

表4 不同濃度HN對缺氧后細胞和培養基中SOD的影響(±s)

組別n SOD(倍)細胞培養基對照組6 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧組6 1.22±0.041)1.29±0.011)10μm ol/L HN+缺氧組6 1.03±0.042)1.25±0.03 20μm ol/L HN+缺氧組6 0.98±0.012)1.08±0.042)與對照組比較,1)P＜0.05;與缺氧組比較,2)P＜0.05

3 討 論

Humanin是2001年由日本學者在老年癡呆患者的大腦皮層枕葉發現的一種由24個氨基酸組成的線性多肽[1]。研究發現,HN可以抑制由Aβ完整肽鏈及Aβ25-35片斷誘導的神經元死亡[2,3]。之后的研究發現,HN除能拮抗Aβ引起的神經細胞死亡之外,還能拮抗家族性遺傳基因突變引起的神經損傷。而對其他原因的損傷似乎不表現保護作用。因此,發現者將其定義為AD特異性的神經保護肽。由于AD發病因素復雜,機制不清,缺乏有效的防治,因此,HN的發現受到了神經科學工作者的廣泛關注,被認為有可能成為未來治療AD的有力工具。但隨著研究的逐步深入發現,HN可以降低Ca2+超載,維持胞內Ca2+穩態;可以提高三磷腺苷(ATP)從而改善細胞功能[4];可以抑制Bax由胞漿轉位至線粒體,從而抑制線粒體途徑的凋亡[5];可以抑制JNK-c-jun及FasL[6]的表達,從而抑制死亡受體途徑的凋亡。HN的上述神經保護機制強烈提示,HN不只是一種特異性針對AD相關損傷的神經保護因子。因為無論是抗凋亡還是降低Ca2+超載或提高ATP改善細胞功能都不可能是只針對某一特定損傷產生保護作用的機制。而且已有的一些實驗研究也提示,HN對AD以外的損傷也具有保護作用,如HN可拮抗東莨菪堿等誘導的神經損傷以及缺血引起的PC12細胞的損傷[7]。鑒于上述因素,設計了本實驗,旨在觀察HN是否可以保護由缺氧造成培養皮層神經元損傷。

本實驗采用的觀察指標包括兩個方面,一是對細胞活力的檢測,包括M TT細胞活力分析及Calcein-AM染色,它們都可用來反映細胞活力從而確定細胞在缺氧及給予HN處理后存活率的變化。另一指標體系是測定與缺氧損傷相關的三種物質的變化:MDA、SOD、LDH[8,9]。MDA是一種在缺氧狀態下生物膜中多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊所形成的一種脂質過氧化物,因而測定MDA的量可反映機體內脂質過氧化的程度,間接反映細胞損傷的程度[10,11]。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合,SOD是以氧自由基連鎖反應前體物O2-為唯一底物的天然酶類清除劑,構成了機體抗活性氧的第一道防線[12]。SOD活性的高低可反映氧自由基水平。所以MDA的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度,而SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。此外,中樞神經元中存在大量LDH,其化學和生物學性質十分穩定。通常情況下神經細胞內的LDH很少釋放,而神經元受損后會引起LDH的大量釋放,因此LDH測定可反映神經細胞損傷程度。

本研究中M TT的活性分析表明缺氧后細胞活性明顯降低,HN(10μmo l/L)可以使細胞活性提高,而HN(20μmol/L)的保護作用則更加顯著。Ca lcein-AM染色結果和M TT活性分析結果相一致,缺氧導致Calcein-AM染色陽性的細胞明顯減少,即有活性的細胞明顯減少。預先應用HN(10μmo l/L)對缺氧的損傷即有保護作用,HN(20μmol/L)的保護作用明顯增強,表現為Calcein-AM陽性染色的細胞明顯增加。缺氧后LDH升高,說明缺氧引起細胞膜破裂,HN預處理后LDH的降低說明HN可以保護細胞膜的完整性。同時HN可以降低缺氧導致的MDA的升高,M DA的升高說明缺氧后脂質過氧化反應增強,而HN可以通過減少脂質過氧化達到保護細胞的作用。雖然有很多研究報道細胞損傷后SOD的活性下降,但是在我們的實驗模型中缺氧后SOD的活性升高,說明缺氧后細胞應對外界損傷的抵抗作用增加。HN作用下SOD的降低也說明了外界的損傷減少,也可以從另一個角度說明HN可以降低外界損傷,對細胞起保護作用。

缺血缺氧是臨床較常見的腦損傷,HN對缺血缺氧損傷的保護作用機制不清,可能與HN可以直接作用于線粒體,提高細胞ATP的含量有關;也可能與HN維持鈣穩態及抑制細胞凋亡有關,確切的保護機制有待于進一步研究。本研究及本實驗室相關的結果提示HN對氧化性損傷具有拮抗作用,可能和LDH、MDA、SOD相關。詳細的作用機制還有待于進一步研究。

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