骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞分化中褪黑素受體和多效蛋白的表達

連 霞,李 麗,李光來,李東芳,王荔,薛國芳

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向神經細胞定向分化的可塑性使其有望成為神經系統疾病細胞及基因治療理想的種子細胞[1]。但目前為止,經誘導分化后的細胞功能距離正常神經細胞仍有較大差距,尚未找到確定穩定的誘導方法。因此有學者提出要得到確定穩定的誘導方法,必須先要了解MSCs向神經細胞分化的具體機制。近期研究發現,多效蛋白(p leiotrophin,PTN)對體外培養的多巴胺能神經元有營養作用,可以促進其生長;褪黑素(melatonin,M el)有促進神經干細胞向神經系細胞分化的作用,并檢測到神經干細胞表達PTN和Mel及其受體m RNA。這些都表明在神經干細胞上存在PTN和Mel信號傳導系統,它們參與了促進神經干細胞的分化。同樣作為神經前提細胞,MSCs在其向神經系細胞分化中Mel受體和PTN m RNA是否表達,是本課題主要探討的內容。

1材料與方法

1.1 材料 骨髓來源于健康成年志愿捐髓者;DM EM(Gibicol公司);胎牛血清FBS(杭州四季青);BME、DMSO(AMRESCO公司)、BHA(中國藥物試劑公司)、神經元特異性醇化酶(NSE)、微管相關蛋白-2(M AP-2)、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、羊抗兔二抗、SABC試劑盒(博士德公司);RNA PCR K it(AMV)Ver.2.1(TKaRa公司);寡核苷酸引物序列(大連寶生物);倒置熒光顯微鏡、CO2培養箱、超靜工作臺;PTC-100型PCR儀;Kodark凝膠數字掃描分析系統等。

1.2 MSCs的分離培養 常規從髂后上棘行骨穿抽取肝素化骨髓4 m L,以淋巴細胞分離液(1.073×103g/m L)進行梯度分離,以5×106/L的細胞密度接種于25 m L的DMEM培養瓶中,在37℃、5%CO2飽和濕度下常規培養。3 d～4 d后首次換液,以后每隔3 d～4 d換液1次。每天在倒置顯微鏡觀察細胞形態及生長速度。

1.3 MSCs的傳代培養 待細胞長至90%以上融合后傳代,按1∶3比例分瓶培養。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長速度。

1.4 MSCs體外誘導分化 取第6代的MSCs按4×105/m L接種于事先放置有消毒蓋玻片的6孔板內培養成單層細胞。實驗組加入含1mmol/L的完全DMEM預誘導24 h[2],對照組加入無誘導劑的完全DM EM。24 h后去除培養液,加入PBS洗滌2次或3次。實驗組以含200μmo l/L BHA+2%DMSO的無血清DMEM作為誘導液處理,對照組不加任何誘導劑。誘導后0.5 h至4 d,觀察細胞形態變化并計數目。

1.5 免疫細胞化學鑒定誘導后神經元樣細胞 誘導后12 h,4%多聚甲醛固定,封閉,加入含抗NSE、M AP-2、GFAP抗體(1∶200)作為一抗,置4℃過夜。PBS洗滌后滴加生物素化羊抗兔二抗,室溫20 min,加SABC室溫20 m in。最后用新配制的DAB液在室溫反應5m in～30 m in,顯微鏡下監測其顏色變化。從上下左右中等5個方位分別選取2個不重復的視野計算總細胞數及抗原表達率(NSE或MAP-2染色陽性細胞率)。

1.6 MSCs向神經元樣細胞分化中MT 1、M T 2和PTN的mRNA表達 誘導前和誘導后12 h檢測M T1、MT2和PTNmRNA的表達。總RNA提取后進行RNA甲醛變性凝膠電泳,檢測RNA純度后進行轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR),按試劑盒使用說明進行,采用二步法,以GADPH為內參照。總體積50μL,反轉錄cDNA后進行擴增,擴增條件分別為:94℃變性5m in后,94℃30 s,60℃30 s,72℃50 s,共35個循環。72℃延伸10 min和94℃變性2 m in,94℃30 s,57.5℃30 s,72℃1 m in,共30個循環。擴增產物進行電泳,結果分析采用KODAK ID凝膠電泳掃描分析系統,將目的條帶做面積和灰度測定得出A值=待測條帶信號面積×條帶灰度值,然后利用作內對照校正,即:待測PCR條帶相對豐度比值(ratio)=待測條帶A值/GADPH條帶A值,實驗重復3次。

2 結 果

2.1 MSCs的分離與原代培養 原代細胞接種24 h后少許細胞開始黏附貼壁,折光性強,呈圓形或橢圓形。3 d后全量換液即見變形細胞,有聚集生長傾向,呈梭狀或多邊形,伸出突起。后貼壁細胞迅速增殖,呈集落狀生長。8 d～10 d細胞呈集簇狀生長,中心呈放射狀或螺旋狀,基本融合。周邊細胞較分散,形態不完全統一。15 d～20 d基本鋪滿瓶底,集落中心細胞增殖明顯,周邊細胞與周圍的集落匯合,完全融合,輪廓不清楚,呈毛玻璃樣。

2.2 MSCs的擴增培養 傳代后生長潛伏期縮短,4 d～6 d可鋪滿瓶底,形態,大小同原代細胞,仍呈現成集落狀生長。傳至第4代～第6代時細胞進一步純化,形態比較均一,高倍鏡下可見胞體有小的顆粒。傳至15代以上,細胞生長速度下降,呈逐漸衰老趨勢,折光性降低,高倍鏡下胞體顆粒增多,胞體逐漸出現空泡,最后懸浮死亡。

2.3 MSCs誘導分化后的形態變化 實驗組誘導后細胞形態開始發生變化,寬大扁平的細胞體開始向胞核收縮;誘導3 h后細胞胞體成圓形,折光性增強,出現雙極及多極細胞。12 h后變形細胞明顯增多,突起變長,交織成網格狀。持續至24 h一些細胞顯示出類似神經元的細胞形態,之后變形細胞增多不明顯,至誘導后3 d懸浮死亡細胞開始增多。對照組仍保持長梭型細胞形態,未見神經樣細胞出現。

2.4 免疫細胞化學鑒定及分化細胞的計數 顯微鏡下觀察各組NSE、MAP-2及GFAP染色陽性細胞數,實驗組誘導后12 h細胞免疫化學染色顯示,大部分絕大多數形態改變的細胞均表達神經元特異性標志NSE、MAP-2,而未檢測到GFAP的表達,與對照無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 MSCs誘導后12 h神經細胞特異性抗原表達率比較(±s)%

表1 MSCs誘導后12 h神經細胞特異性抗原表達率比較(±s)%

組別NSE MAP-2 GFAP對照組2.050±0.021 2.250±0.0231 2.000±0.022實驗組64.790±0.069 60.050±0.093 2.350±0.019 P＜0.01 ＜0.01＞0.05

2.5 MSCs誘導后PTNm RNA的表達(見表2、圖1、圖2)

表2 MSCs誘導后PTNmRNA表達的相對豐度比值比較(±s)

表2 MSCs誘導后PTNmRNA表達的相對豐度比值比較(±s)

組別誘導前誘導后12 h對照組0.209±0.020 0.184±0.0191)實驗組0.196±0.013 0.689±0.0171)2)與同組誘導前比較,1)P＜0.01;與對照組誘導后12 h比較,2)P＜0.01

圖1 PTN rt-PCR電泳圖譜

圖2 GADPH rt-PCR電泳圖譜

2.6 MSCs誘導后MT1 M T2 mRNA的表達(見表3) RTPCR產物中,可見大370bp MT1cDNA的陽性條帶,而未見大小約320bp M T2cDNA的陽性條帶呈陰性,未表達MT2亞型。對照組未擴增出陽性條帶,排除了總RNA中的污染基因組DNA引起的假陽性的可能。β-actin內對照呈陽性,說明總RNA抽提物是正常的。

表3 MSCs誘導后MT1 m RNA表達的相對豐度比值(±s)

表3 MSCs誘導后MT1 m RNA表達的相對豐度比值(±s)

組別誘導前誘導后12 h對照組0.189±0.026 0.223±0.5061)實驗組0.190±0.012 0.778±0.0721)與同組誘導前比較,1)P＜0.01

3 討 論

2000年Woodbury等[2]發現MSCs在一定誘導條件下可向神經元樣細胞分化。此后很多學者嘗試用不同的方法誘導MSCs向神經元樣細胞分化,但是始終未能找到公認穩定的誘導方法。經誘導分化后細胞功能距離正常神經細胞仍有較大差距,存活時間短,不能有效增殖,難于應用于體內。鑒于此,許多學者認為,要找到確定穩定的誘導方法,必須清楚MSCs向神經細胞分化的具體機制。目前研究認為MSCs的這種跨胚層或跨系分化的基礎最有可能是轉分化[3]現象。在分子水平上,轉分化發生在關鍵發育基因表達改變的基礎上,這些基因決定胚胎的各個區域發育為成體的不同部分。因此,了解這些關鍵基因的表達,對于探索MSCs分化的機制甚為重要。Pleiotrophin(PTN)以前稱為肝素結合樣生長因子-8,因其具有多種功能而被重新命名為多效蛋白。其基因PTN是高度保守的基因家族[4],可以啟動培養的胎鼠腦細胞軸突的生長發育,在神經組織的發育和/或維持中起一定作用。故PTN也被稱為軸突生長刺激因子。近期研究發現,PTN對體外培養的多巴胺能神經元有營養作用[5]。并在神經干細胞中高表達,并刺激其進一步分化為多巴胺能神經元[6]。Furuta等[7]也檢測到神經干細胞表達PTN及其受體mRNA。國內研究也發現誘導臍血來源的間充質干細胞向神經元樣細胞分化后也表達PTNmRNA[8]。褪黑素在許多脊椎動物如雞、小鼠、綿羊等的胚胎發育中發揮重要作用。研究顯示褪黑素受體在人類胚胎的腦部組織中表達[9,10],特別是MT1亞型在人胚胎腦部組織中廣泛表達[11]。有研究報道Mel受體通過抑制環磷腺苷(cAMP)途徑,在視神經及視網膜的發育過程中發揮作用[12]。Niles等[13]在神經干細胞向神經系細胞分化過程中檢測到M el受體亞型mRNA的表達,Mel可能有增強神經干細胞GDNF m RNA表達的作用。M oriya等[14,15]研究發現M el可促進神經干細胞向神經系細胞分化。國內研究發現褪黑素可促進MSCs向神經樣細胞分化[16]。這些都表明在神經干細胞上存在PTN和Mel信號傳導系統,并對神經干細胞的分化有重要作用。MSCs同樣作為神經前提細胞,其在向神經系細胞分化中PTN和M T1的表達情況如何?；诖?本課題探討成人MSCs向神經元樣細胞分化中Mel受體和PTN mRNA的表達情況,發現實驗組在誘導后12 h有Mel受體MT1亞型和PTN mRNA的表達,考慮MSCs在向神經系細胞分化中PTN和Mel信號傳導系統可能也參與了細胞分化的調控。但具體作用如何,其表達有無變化,上下游的信號傳遞是怎樣的,通過調控其表達量是否能促進MSCs向神經系細胞的分化則需要進一步的探索。

[1] K im S,H onmou O,Kato K,eta l.Neu raldifferentiation potential of peripheral blood-and bone-marrow-derived precu rsor cells[J].B rain Res,2006,1123(1):27-33.

[2] W oodbury D,Schwarz EJ,Prockop DJ,et al.Adult rat and human bonemarrow stromal cells differentiate into neurons[J].JNeurosci Res,2000,61(4):364-370.

[3] Sanchez-Ram os JR.Neural cells derived from adult bone marrow and umbilical cord blood[J].JNeurosci Res,2002,69(6):880-893.

[4] Li YS,H offman RM,Le Beau MM,et a l.Characterization of the human pleiotrophin gene.Prom oter region and chromosomal localization[J].JBiolChem,1992,267(36):26011-26016.

[5] H ideki H.Pleiotrophin exhibits a trophic effect on survival of dopam inergic neu rons in vitro[J].Eu r JNeurosci,2003,17(10):2127-2134.

[6] Jung CG,H ida H,Nakahira K,eta l.Pleiotrophin m RNA is high ly expressed in neural stem(p rogenitor)cells of mouse ventralmesen cephalon and the product prom otes production of dopam inergic neurons from emb ryonic stem cell-derived nestin-positive cells[J].FASEB J,2004,18(11):1237-1239.

[7] Furu ta M,Shiraishi T,Okam oto H,etal.Iden tification of pleiotrophin in conditioned medium secreted from neu ral stem cells by SELDI-TOF and SELDI-tandem mass spectrometry[J].Brain Res Dev Brain Res,2004,152(2):189-197.

[8] 馬廉,楊立業.人臍帶間充質干細胞的生物學特性及向神經樣細胞分化的研究[J].中華兒科雜志,2006,44(7):513-517.

[9] Yuan H,Lu Y,Pang SF.Binding characteristicsand regionaldistribu tion of[125I]iodom elatonin binding sites in theb rain of thehuman fetus[J].Neu rosci Lett,1991,130(2):229-232.

[10] Thomas L,D rew JE,Ab ramovich DR,eta l.The role ofmelatonin in the human fetus[J].In t JMol M ed,1998,1(3):539-543.

[11] Thomas L,Pu rvis CC,Drew JE,et al.M elatonin receptors in human fetal brain:2-[(125)I]iodomelatonin binding and MT 1 gene expression[J].JPineal Res,2002,33(4):218-224.

[12] Iuvone PM,Gan J.Melatonin receptor-m ediated inhibition of cyclic AM P accum ulation in chick retinal cell cu ltures[J].JNeurochem,1994,63(1):118-124.

[13] Niles LP,A rmstrong KJ,Rincón Castro LM,et a l.Neural stem cells expressmelatonin receptors and neu rotrophic factors:Colocalization of the M T1 receptor with neu ronal and glial markers[J].BMC Neu rosci,2004,5:41.

[14] Moriya T,H orie N,M itom e M,et al.Effect ofm elatonin on the proliferative and differentiative activity of neuralstem cell[J].Int Clin Psychopharmacol,2005,20(3):A 14.

[15] Mo riya T,H orie N,M itom e M,et a l.Melatonin influences the p roliferative and differentiative activity of neu ral stem cells[J].J Pineal Res,2007,42(4):411-418.

[16] 張蒙夏.成年SD鼠骨髓間充質干細胞的細胞分化及抗凋亡的研究[J].解剖學報,2003,34(1):40-44.