辛伐他汀預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

劉艷明,張林明,馬靜萍

辛伐他汀是一種羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,臨床上作為一種調(diào)血脂藥物而廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治。近來的研究表明,辛伐他汀除有降低膽固醇作用外還具有多種神經(jīng)保護功能,降低卒中的發(fā)病率并減輕再灌注損傷[1,2],其保護作用與抗細(xì)胞凋亡有關(guān),但對其詳細(xì)分子機制并不十分清楚,故本實驗對此進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 辛伐他汀購于杭州默沙東制藥有限公司,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-T ripheny l tetrazolium chloride,TTC)購于Sigma公司;Fas抗體,SABC法免疫組化檢測試劑,TUNEL原位標(biāo)記成套試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物及分組 健康雄性SD大鼠36只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重250 g～300 g,隨機分為假手術(shù)組、模型加溶媒組、辛伐他汀預(yù)處理組,每組12只。

1.3 給藥方法 辛伐他汀用生理鹽水配制成懸浮液,大鼠術(shù)前10 d按辛伐他汀20 mg/kg灌胃,1次/日,模型加溶媒組給予相同體積的生理鹽水。

1.4 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備 大鼠連續(xù)灌胃10 d后,第11天以線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型(缺血2 h,再灌注24 h)。10%水合氯醛(350 g/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后,分離右頸總動脈并剪一小口,將直徑0.215 mm國產(chǎn)尼龍線頭端燒成光滑杵狀(直徑0.26 mm～0.30 mm)插入,以頸總動脈分叉處計算進線深度為(18.0±0.5)mm,至大腦中動脈起始部以完全阻斷血供。再灌注時外拉尼龍線,即可恢復(fù)頸內(nèi)動脈及大腦中動脈的血液供應(yīng)。模型成功的標(biāo)志是大鼠出現(xiàn)右眼H orner征;提尾時左前肢內(nèi)收屈曲;爬行時向左側(cè)傾倒或按逆時針方向轉(zhuǎn)圈。假手術(shù)組除不插入線栓外,其他操作步驟同上。

1.5 神經(jīng)功能評分 參照Zea Longa等的方法在大鼠MCAO/R術(shù)后清醒時進行神經(jīng)功能評分。0分:無明顯神經(jīng)功能缺損;1分:不能伸展左側(cè)前肢;2分:行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分:行走時向左側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。評分為0分和4分者均被剔除。

1.6 標(biāo)本制作 模型成功后,于再灌注24 h用4%的甲醛溶液行心臟灌流固定后斷頭取腦,自視交叉向前后各取2.5 mm左右的冠狀腦片,充分固定脫水透明后石蠟包埋,連續(xù)切片作HE染色免疫組化和TUNEL。

1.7 光鏡觀察及免疫組織化學(xué)檢測 按SABC三步法免疫組化檢測試劑盒說明書步驟進行,Fas免疫陽性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色或棕黃色。

1.8 細(xì)胞凋亡的檢測 光鏡下神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)中有棕黃色顆粒的為陽性,于陽性細(xì)胞分布區(qū)隨機選擇5個不重復(fù)高倍鏡視野(10×40),以每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)作為凋亡的量化指標(biāo),計算陽性細(xì)胞百分比。

1.9 腦梗死體積的測定 術(shù)后24 h予以10%水合氯醛(350 g/100 g)麻醉,斷頭取腦,迅速置于-20℃冰箱凍存10m in;去除嗅球、小腦和低位腦干,其余部分行冠狀位切片,從額極向后作每2 mm切片,共5片,然后迅速將腦片置于2%TTC溶液中,避光,37℃溫孵30 m in,溫孵完畢后數(shù)碼相機照相,將染色結(jié)果輸入計算機,利用圖像處理軟件AutoCAD分別計算出各個腦片缺血側(cè)的面積和梗死區(qū)域的體積,求出梗死區(qū)域占大腦半球總體積的百分比。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀預(yù)處理對大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分的影響(見表1) TTC染色結(jié)果可見,假手術(shù)組經(jīng)TTC染色后腦片全紅,模型加溶媒組大鼠右側(cè)額、頂葉皮質(zhì)及紋狀體可見明顯的白色梗死灶,辛伐他汀預(yù)處理組的梗死體積明顯縮小,與模型加溶媒組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)出明顯神經(jīng)運動功能障礙,而辛伐他汀預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均獲不同程度改善,肌力明顯增加,與模型加溶媒組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

表1 各組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

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2.2 辛伐他汀預(yù)處理對大鼠Fas表達(dá)的影響(見表2) 辛伐他汀預(yù)處理組、模型加溶媒組與假手術(shù)組相比,Fas表達(dá)顯著增強(P＜0.01),辛伐他汀預(yù)處理組與模型加溶媒組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 辛伐他汀預(yù)處理對大鼠凋亡細(xì)胞的影響(見表2) 假手術(shù)組:每高倍視野罕見凋亡細(xì)胞。腦缺血再灌注損傷CIRI時,腦細(xì)胞凋亡數(shù)目增多,辛伐他汀預(yù)處理組可明顯減少凋亡細(xì)胞數(shù)目,但仍較假手術(shù)組多(P＜0.01)。

表2 各組Fas表達(dá)陽性率、凋亡細(xì)胞表達(dá)陽性率比較(±s)%

表2 各組Fas表達(dá)陽性率、凋亡細(xì)胞表達(dá)陽性率比較(±s)%

組別n Fas TUNEL假手術(shù)組6 7.25±1.31 1.48±0.46模型加溶媒組6 65.43±4.571)44.52±4.131)辛伐他汀預(yù)處理組6 31.64±2.682)30.23±3.152)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型加溶媒組比較,2)P＜0.01

3 討 論

研究顯示在腦缺血再灌注損傷中凋亡可能決定了最終梗死的體積[3]。辛伐他汀對腦缺血再灌注有直接的保護作用,其保護作用與抗細(xì)胞凋亡有關(guān),武祺等[4]研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀可以減小大鼠大腦缺血再灌注后的腦梗死體積,下調(diào)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)率,抑制腦組織細(xì)胞凋亡,但其詳細(xì)的抗凋亡機制尚不明確。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡,目前研究認(rèn)為凋亡存在兩種相互關(guān)聯(lián)的途徑:細(xì)胞表面死亡受體途徑和線粒體途徑[5]在眾多介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路中,Fas/FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡中最主要的途徑之一。Fas,即Apo-1/CD95,屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員,是I型跨膜受體蛋白。具有1個跨膜結(jié)構(gòu),C末端位于細(xì)胞外,具有3個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域;細(xì)胞內(nèi)存在一個誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的特殊結(jié)構(gòu)域——凋亡結(jié)構(gòu)域[6]。人Fas基因定位于第10號染色體(10q24),其基因長度為2 534bp共有8個內(nèi)含子和9個外顯子,編碼319個氨基酸[7]。大量研究結(jié)果表明:Fas在凋亡事件中起傳遞信號的作用[8-11],首先FasL與Fas結(jié)合形成三聚體,之后FasL死亡區(qū)與Fas死亡區(qū)結(jié)合蛋白FADD結(jié)合,激活Caspase-8,從而引起一系列Caspase酶聯(lián)反應(yīng),引起細(xì)胞骨架降解和DNA片段化。Fas介導(dǎo)敏感性細(xì)胞死亡,至少具備3個條件:細(xì)胞表達(dá)功能性Fas死亡受體;Fas與FasL與其抗體交聯(lián)形成聚體;胞內(nèi)凋亡拮抗程序關(guān)閉[12]。

腦缺血再灌注后表達(dá)Fas蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加,尤以缺血周圍區(qū)明顯,且Fas細(xì)胞表達(dá)分布廣泛,主要分布于皮質(zhì)及海馬的神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[13],Fas主要表達(dá)于胞漿和胞膜[14],說明Fas可能介導(dǎo)了腦缺血后細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Rosenbaum等[15]對野生型和Fas基因突變鼠前腦缺血后神經(jīng)元凋亡情況的研究發(fā)現(xiàn),兩組鼠在缺血24 h后均有神經(jīng)元凋亡,但Fas基因突變型鼠腦梗死面積明顯減小。Matsuyama等[16]的研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后,在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、腦室膜細(xì)胞表面有Fas的高表達(dá),并與凋亡細(xì)胞分布一致。白文婷等[17]的研究發(fā)現(xiàn),Fasm RNA水平于局灶性腦缺血2 h,再灌注6 h起開始有少量表達(dá),于24 h達(dá)到高峰后逐漸下降.目前關(guān)于Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能分子機制[18];Fas與FasL相互作用直接破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu),使核板斷裂;Fas與FasL結(jié)合激活Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;Fas與FasL的相互作用可滅活細(xì)胞凋亡抑制劑;Fas與FasL通過水解使細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白的催化結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)分離,從而影響調(diào)節(jié)的功能,細(xì)胞骨架塌陷。

在本實驗中,假手術(shù)組Fas有少量表達(dá),模型加溶媒組表達(dá)較假手術(shù)組顯著增強(P＜0.01),且表達(dá)主要分布在缺血周圍區(qū),即缺血半暗帶;細(xì)胞陽性表達(dá)以胞膜和胞漿為主,提示Fas參與了細(xì)胞凋亡。辛伐他汀預(yù)處理組,Fas表達(dá)減少,與模型加溶媒組比較有統(tǒng)計學(xué)意義,但較假手術(shù)組仍多。本實驗還發(fā)現(xiàn)辛伐他汀預(yù)處理組凋亡細(xì)胞率減少,并且與Fas表達(dá)分布腦區(qū)相一致,分析這與Fas的表達(dá)降低有關(guān),從而減小腦梗死體積,改善神經(jīng)功能評分,發(fā)揮腦保護作用.辛伐他汀預(yù)處理對腦缺血/再灌注損傷有明顯的保護作用,其機制可能與減少Fas的表達(dá),發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[1] 謝坤,李勇.他汀類藥物的多效性研究[J].世界臨床藥物,2005,26:589-591.

[2] Tobert JA.Lovastatin and beyond:The history of the HMG-CoA reductase inhibitors[J].Nat Rev Drug Discov,2003,2:517-526.

[3] H su CY,An G,Liu JS,et al.Expression of imm ediate early gene and g row th factorm RNAs in a facal cerebral ischemiamodle in the rat[J].Stroke,1993,24(Supple 1):78-81.

[4] 武祺,李欣.辛伐他汀對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護作用[J].中國腦血管病雜志,2007,4(9):410-413.

[5] Zeiss CJ.The apoptosis-necrosis continuum:Insigh ts from genetically altered m ice[J].Vet Pathol,2003,40:481-495.

[6] Martin A,Herr I,Jeremias I,et al.CD95 ligand(Fas-L/APO-1L)and TNF related apoptosis inducing ligand mediate ischem ia-induced apoptosis in neurons[J].JNeurosci,1999,19:3809-3817.

[7] 盧紅陽,馬勝林,余新民.Fas及Fas配體與惡性淋巴瘤[J].國外醫(yī)學(xué):腫瘤學(xué)分冊,2005,32(3):221-223.

[8] Chen M,Wang J.Initiator caspases in apoptosis signaling pathw ays[J].Apoptosis,2002,7:313-319.

[9] Salvesen GS,Dixit VM.Caspaseactivation:The induced proximitymodel[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:10964-10967.

[10] H engartner MO.Thebiochem istry of apoptosis[J].Natu re,2000,407:770-776.

[11] Kaufm ann SH,Earnshaw WC.Induction of apoptosis by cancerchemotherapy[J].Exp Cell Res,2000,256:42-49.

[12] W eller M,Malipiero U,Rensing-Ehl A,et a l.Fas/APO-1 gene transfer for human malignant glioma[J].Cancer Res,1995,55(13):2936-2944.

[13] Martin V illalba A,Hahne M,K leber S,etal.Therapeutic neutralization of CD95 ligand and TNF attenuatesb rain damage in stroke[J].Cell Death Differ,2001,8(7):679-686.

[14] Jin K,Graham SH,Mao X,etal.Fas(CD95)maymediate delayed cell death in hippocampal CA 1 sector after global cereb ral ischem ia[J].Cereb Blood Flow Metab,2001,21(12):1411-1421.

[15] Rosenbaum DM,Upta G,DpAmore J,et a l.Fas(CD 95/Apo-1)plays a role in the pathophysilogy of focal cereb ral ischem ia[J].Neurosci Res,2000,61(6):686-692.

[16] Matsuyama T,H ataR,Yam am oto Y,etal.Localization of Fasanti-gen mRNA indu ced in post ischem icmu rine fo rebrain by insitu hyb ridization[J].Brain Res,1995,34(1):166-172.

[17] 白文婷,陳立杰.大鼠局灶性腦缺血再灌注后fas基因和fasl基因表達(dá)變化的規(guī)律[J].中國臨床康復(fù),2004,8(34):7692-7693.

[18] 丁欣.Fas蛋白在糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)的表達(dá)及意義[J].解剖科學(xué)進展,2008,14(3):284-286.