奇智方對人臍靜脈內皮細胞ICAM-1和ICAM-1m RNA表達的影響

張淑霞

內皮細胞損傷是腦缺血損害的早期病變和基本動因,它的功能障礙與腦血管病的發生、發展密切相關。近年研究表明,內皮細胞上表達有多種黏附分子,其中,主要介導白細胞黏附、移行的細胞間黏附分子-1(ICAM-1),是導致和加重腦缺血狀態下組織損傷的重要因素之一。本研究采用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-304),進行ICAM-1及其轉錄水平(ICAM-1 mRNA)表達的離體實驗研究,觀察奇智方對血管內皮功能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 KM小鼠,SPF級,體重18 g～22 g,雄性。湖北省衛生防預站實驗動物室提供。合格證書:醫動字第19-082。Wistar大鼠,SPF級,體重190 g～210 g,雄性。湖北省衛生防預站實驗動物室提供。合格證書:醫動字第19-084。

1.2 藥物 奇智方由黃芪、川芎、水蛭、膽南星、石菖蒲等組成,由湖北中醫學院附屬醫院制劑室按95國家藥典標準配制成煎膏劑,用時用雙蒸水配成混懸液。西藥喜得鎮(H ydergin)片劑,每片1mg,天津華津制藥廠與瑞士山德士藥廠合作生產(批號:960923),用時研碎加雙蒸水配成混懸液。

1.3 主要試劑與儀器 人臍靜脈內皮細胞系(美國A TCC),武漢大學細胞中心提供;D-MEM培養基:GIBCO公司產品;MTT試劑盒:SIGM A公司生產;TMB試劑盒:AMRESCO公司生產;羊抗鼠IgG-HRP:華美生物工程公司生產(批號:GMH 51212);抗人CD54(ICAM-1)單克隆抗體及檢測試劑:SIGMA公司生產(貨號:C7219);ICAM-1m RNA原位雜交檢測試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司。

酶標儀:UIRION Reader A(英國);二氧化碳培養箱:Forma Scientific;超凈工作臺:蘇州凈化設備廠生產;培養板:Costar公司產品;二氧化碳:武漢無機鹽廠生產。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清制備 Wistar大鼠含藥血清制備:取大鼠25只,隨機分成5組,每組5只。對照組大鼠灌服生理鹽水15 mL/kg;中藥高、中、低劑量組大鼠灌服中藥40g/kg、30g/kg、10g/kg;陽性對照組大鼠灌服喜得鎮0.27 mg/kg。每只大鼠灌胃給藥共5次,即每天早、晚各給藥1次,連續2 d,第3天早上再給藥1次。于末次給藥后1 h,從大鼠心臟采血,置4℃冰箱過夜,吸取血清,并將各份血清進行等量混合后,56℃30 m in滅活處理,置-20℃低溫保存備用。KM小鼠含藥血清制備:取小鼠100只,每組20只。對照組小鼠灌服生理鹽水25 m L/kg;中藥高、中、低劑量組小鼠灌服中藥50 g/kg、37.5 g/kg和12.5 g/kg;陽性對照組小鼠灌服喜得鎮0.4 mg/kg。每只小鼠灌胃給藥共5次,方法同大鼠。于末次給藥后1 h,眼眶取血,分離血清,方法同大鼠。

1.4.2 人臍靜脈內皮細胞培養 按常規方法進行細胞培養,將生長成致密單層的HUECV-304細胞用0.25%胰酶消化。在室溫下放置10 min,倒去消化液,加入10 m L培養液,制成細胞懸液。接種于96孔板,每孔0.2 m L。置培養箱37℃、5%CO2的環境下培養,細胞生長至底面積的70%～80%時進行實驗。

1.4.3 藥物抗人臍靜脈內皮細胞缺氧試驗 取大、小鼠含藥血清及正常血清(每孔40μL)、生理鹽水(每孔40μL)加入96孔組織培養板中。將96孔組織培養板放入缺氧槽內,在密封條件下,充入大量的氮氣,37℃放置30 min后取出,放回CO2培養箱中培養1 h;再放入缺氧槽內30 min,又放回CO2培養箱中繼續培養。在缺氧試驗開始后0 h、4 h、12 h、24 h、48 h分別觀察細胞生長情況以及于缺氧試驗第0 h、2 h、6 h、16 h,測定大、小鼠含藥血清對其ICAM-1的表達情況。在48 h測定人臍靜脈內皮細胞活性(MTT法)。

1.4.4 人臍靜脈內皮細胞ICAM-1表達測定(ELISA法) 在缺氧試驗后的0 h、2 h、6 h、16 h時段分別按劑量組取出培養的96孔細胞板。實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.4.5 人臍靜脈內皮細胞活性測定(M TT法) DME培養液加入經56℃、30 m in滅活的新生小牛血清終濃度為10%。將生長致密單層的細胞用0.25%的胰酶消化,室溫10 min,倒去消化液,加入10 m L培養液,反復吹打,制成細胞懸液,計數后調整細胞濃度為2×106/m L,將細胞懸液加入24孔培養板中,每孔1 m L,中藥高、中、低劑量組、喜得鎮陽性對照組(陽性對照組),另設生理鹽水對照組(生理鹽水組)、血清對照組(正常血清組)加無菌PBS,每組作4個～5個平行孔,置5%CO2、37℃培養48 h。培養結束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7 m L;加入0.7 m L不含小牛血清DME培養液,同時加入MTT每孔50 μL,繼續培養4 h后,每孔加入1 m L酸性異丙醇溶液,吹打混勻,使紫色結晶完全溶解,然后分裝到96孔酶表板中,每個劑量組分裝4孔～5孔作為平行標,用酶標儀以570 nm波長測定光密度值。

1.4.6 人臍靜脈內皮細胞ICAM-1mRNA表達測定 細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養,條件為37℃和5%的CO2,所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1 mol/L PBS(PH 7.4)洗2 m in,每分鐘3次。用含有1/1 000 DEPC的4%多聚甲醛/0.1mol/L PBS固定培養細胞,室溫,固定30 m in～60 m in。新鮮配制0.5%H2O2/甲醛室溫處理30 min,蒸餾水洗滌3次。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,37℃消化30 s～120 s。0.5mo l/L PBS洗3次,每分鐘5次。蒸餾水洗1次。按每張切片20μL加預雜交液,放入濕盒中,恒溫箱37℃～40℃2 h～4 h。吸取多余液體,不洗。按每張切片20μL雜交液,放入濕盒中,恒溫箱37℃～40℃雜交過夜。雜交之后的樣本用30℃～37℃水溫的2×SSC洗滌5 min,每分鐘2次,0.5×SSC洗滌15 m in,每分鐘1次,0.2×SSC洗滌15 m in,每分鐘1次。之后,滴加封閉液,37℃30 min。甩去多余液體,不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60 min,0.5mol/L PBS洗滌5 m in,每分鐘4次。滴加SABC,37℃20m in,0.5mol/L PBS洗5 m in,每分鐘3次。滴加生物素化過氧化物酶:37℃20 m in,0.5 mol/L PBS洗5 m in,每分鐘4次。使用DAB顯色試劑盒,一般顯色20m in～30m in。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。酒精脫水,二甲苯透明,封片。

2 結 果

2.1 缺氧試驗后細胞生長情況觀察 正常細胞胞體呈多角形或梭形,相互嵌合為單層,呈鋪路石狀排列;缺氧試驗后大鼠血清組和小鼠血清組細胞生長和形態變化基本一致。在12 h內細胞處于生長休止狀態,無增殖現象;24 h中藥高劑量組和陽性對照組生長明顯,基本形成單層;48 h形成致密單層細胞,細胞形態基本正常。中藥中、低劑量組細胞生長情況較高劑量差;正常血清組和生理鹽水組的細胞形態隨時間延長細胞間隙增寬,折光度暗,細胞皺縮變形,胞漿濃縮并出現顆粒狀,24 h后開始出現脫落,48 h脫落明顯。

2.2 人臍靜脈內皮細胞活性測定結果 經MTT法檢測,其OD值結果顯示,血清組與生理鹽水組比較無統計學意義(P＞0.05),中藥各劑量組和陽性對照組與生理鹽水組比較均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01),大鼠藥理血清與小鼠藥理血清對HUVEC活性研究結果基本一致。3個不同劑量治療組的OD值表現出明顯的量效關系,即:奇智方抗缺氧效果呈劑量依賴性。詳見表1、表2。

表1 大鼠藥理血清對人臍靜脈內皮細胞活性作用測定(±s)

表1 大鼠藥理血清對人臍靜脈內皮細胞活性作用測定(±s)

組別藥物終濃度mg/m L OD值中藥高劑量組80 0.782±0.051中藥中劑量組60 0.689±0.019中藥低劑量組20 0.546±0.017陽性對照組0.2 0.735±0.017生理鹽水組—0.181±0.012正常血清組—0.201±0.027

表2 小鼠含藥血清對人臍靜脈內皮細胞活性作用測定(±s)

表2 小鼠含藥血清對人臍靜脈內皮細胞活性作用測定(±s)

組別藥物終濃度OD值中藥高劑量組10 g/(kg?m L)1.230±0.073中藥中劑量組7.5 g/(kg?m L)0.950±0.043中藥低劑量組2.5 g/(kg?m L)0.480±0.039陽性對照組0.08m g/(kg?m L)1.180±0.059生理鹽水組 -0.400±0.042正常血清組 -0.335±0.033

2.3 人臍靜脈內皮細胞ICAM-1表達測定結果(見表3) 通過細胞培養和ELISA法測定發現HUVEC在正常情況下僅表達少量的ICAM-1蛋白分子,經反復缺氧/復氧后2 h表達量開始升高,6 h～16 h達高峰;治療組及陽性對照組與血清組比較均有統計學意義(P＜0.01),可明顯抑制HUVEC-304缺氧/復氧后6 h～16 h表達ICAM-1,中藥高劑量組與陽性對照組比較,效果更優,但差異無統計學意義(P＞0.05);中藥治療組不同劑量組比較呈明顯的量效關系。

表3 大鼠藥理血清對人臍靜脈內皮細胞ICAM-1表達測定(±s)

表3 大鼠藥理血清對人臍靜脈內皮細胞ICAM-1表達測定(±s)

OD值組別n 0 h 2 h 6 h 16 h中藥高劑量組6 0.203±0.007 0.273±0.0062)0.342±0.0072)0.415±0.0232)中藥中劑量組6 0.215±0.014 0.305±0.0062)0.396±0.0072)0.492±0.0172)中藥低劑量組6 0.214±0.008 0.295±0.0132)0.516±0.0072)0.617±0.0222)陽性對照組6 0.209±0.014 0.251±0.0062)0.361±0.0062)0.455±0.0172)正常血清組6 0.206±0.007 0.301±0.005 0.701±0.007 0.853±0.020生理鹽水組6 0.213±0.008 0.321±0.0052)0.795±0.0082)0.908±0.0161)與血清對照比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.4 人臍靜脈內皮細胞ICAM-1mRNA表達測定結果(見表4)通過細胞培養、缺氧/復氧6 h和原位雜交實驗,結果表明:在體外培養的HUVEC經缺氧/復氧后,細胞內ICAM-1m RNA轉錄明顯上調,與正常對照組比較有統計學意義(P＜0.01);中藥治療組和陽性對照組均能明顯使缺氧/復氧后細胞ICAM-1 m RNA下調,與缺氧組比較有統計學意義(P＜0.01);中藥治療組與陽性對照組比較有統計學意義(P＜0.05)。

表4 中藥對人臍靜脈內皮細胞缺氧后ICAM-1m RNA表達的影響(±s)

表4 中藥對人臍靜脈內皮細胞缺氧后ICAM-1m RNA表達的影響(±s)

組別n ICAM-1mRNA表達(%)正常對照組6 1.42±0.84缺氧組6 24.78±0.911)陽性對照組6 4.35±0.722)中藥治療組6 1.87±1.362)3)與正常對照組比較,1)P＜0.01;與缺氧組比較,2)P＜0.01;與陽性對照組比較,3)P＜0.05

3 討 論

血管內皮細胞是位于循環血液與血管壁內皮下組織間的單層細胞。它并非單純官腔內襯和屏障,而是具有抗凝、抗血栓形成、纖溶等廣泛生理功能的內分泌器官。近幾年研究表明,內皮細胞可分泌多種細胞因子(cy tokines),許多細胞因子可促進黏附分子在內皮細胞表達,如:細胞間黏附分子(ICAM)、細胞黏附分子(VCAM)、整合素(integrin)族黏附分子和選擇素(selectin)族黏附分子。黏附分子是由細胞產生,存在于細胞表面,介導細胞與細胞間或細胞與基質間相互接觸和結合的一類分子[1,2],20世紀80年代后期,人們發現血管內皮細胞上表達有多種黏附分子,其中,介導白細胞附壁滾動的主要是選擇素家族,介導白細胞黏附、移行的主要是ICAM-1[3,4]。

ICAM-1屬于免疫球蛋白家族黏附分子,為單鏈跨膜糖蛋白,由5個Ig樣結構的細胞外區、1個較短的胞質區組成,血管內皮細胞表達最強。正常情況下,內皮細胞ICAM-1表達較低,白細胞極少與內皮細胞黏附,即使偶爾黏附也很快分開,不影響血液循環。但是,在腦缺血等病理情況下,ICAM-1明顯上調[5],腦缺血再灌注后快速恢復的血流是加重缺血區損傷的重要原因[6],在缺血再灌注時局部血管內皮細胞和白細胞被病變組織產生的大量炎性介質激活,細胞表面黏附分子數量和功能明顯上調,造成白細胞和內皮細胞大量牢固黏附,白細胞聚集,進而貼壁、滾動、嵌塞微血管,造成局部血流動力學改變;此外,活化的白細胞可以釋放大量的毒性物質損傷神經元和膠質細胞,加重組織損傷。另外,白細胞還釋放一些炎性介質和細胞因子,加重炎性反應,并吸引更多的白細胞進入組織,形成惡性循環。

內皮細胞損傷是腦缺血損害的早期病變和基本動因,它的功能障礙與腦血管病的發生、發展密切相關。腦缺血時,可刺激內皮細胞合成多種細胞因子:IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等[7,8],從而促進內皮細胞分泌黏附分子,增加中性粒細胞和內皮細胞的黏附,引起內皮細胞的缺血損傷[5,9]。目前國內外對腦缺血損傷黏附分子的研究尚處于起步階段,腦缺血損傷引起內皮細胞黏附分子的一系列變化還沒有一個統一的概念,因此,研究轉錄水平和蛋白水平黏附分子的表達對深層次追蹤腦缺血損傷發生機制及干預防治具有重要的理論意義和臨床價值[10]。隨著ICAM-1所介導的白細胞與內皮細胞黏附增強,在缺血性腦損傷中的作用日益明確,人們將開始尋找新的措施來預防和治療缺血性腦損傷[11]。

HUVEC-304是由人臍靜脈內皮細胞轉化的細胞系,可以表達內皮細胞標志如Weibel-Palada小體、PA等,它可以進行穩定傳代培養,是原代內皮細胞培養的良好模型[12]。本研究選用此細胞系作為研究對象,以反復缺氧/復氧實驗模擬血管內皮細胞在缺血再灌注條件下的環境,能消除在體和離體血管中難以控制的神經體液內皮細胞的影響,更好地控制培養液中細胞所處的理化環境,并觀察藥物直接對血管內皮細胞的保護效應。

觀察研究發現反復缺氧/復氧實驗能使血管內皮細胞活化而明顯表達ICAM-1和ICAM-1mRNA,奇智方能抑制其表達,并呈明顯的量-效關系,提示:奇智方主要通過抑制內皮細胞ICAM-1mRNA的水平而影響其表面ICAM-1蛋白的表達,抑制內皮細胞活化表達ICAM-1和ICAM-1mRNA可能是奇智方的免疫抑制機制的分子基礎之一。

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