八氫番茄紅素合成酶（PSY2）基因果實特異表達載體的構建

劉順枝，朱雪嬌，楊禮香，王小蘭

（廣州大學生命科學學院，廣東廣州，510006）

番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素，它廣泛存在于水果及蔬菜中，在番茄、杏、番石榴、西瓜、番木瓜、紅葡萄柚、紅肉臍橙中均含有較多的番茄紅素，尤以番茄中的含量為最高。八氫番茄紅素合成酶（PSY）是植物類胡蘿卜素生物合成途徑中促進番茄紅素合成的上游的關鍵酶，催化兩分子的GGPP縮合形成八氫番茄紅素，PSY基因最早在番茄中分離鑒定，目前從番茄中分離得到PSY1和PSY2，其中，PSY1基因在番茄果實和花中特異性表達，而PSY2基因則主要在番茄葉片中表達[1]。除番茄和玉米外，現已分離出PSY基因的植物還有辣椒（X68017）、擬 南 芥 （L25812）、 番木瓜 （ABG72805）、 枸杞（AAW88383）、葡萄柚（AF152892）等。 近年來，番茄紅素的抗氧化活性的發現，以及在流行病學研究中Lyp濃度與前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胃腸癌、乳腺癌、膀胱癌等的發生率呈負相關，引起了科研人員的密切關注[2]。植物番茄紅素基因工程取得了可喜的進展。Burkhardt等[3]將黃水仙PSY基因在水稻胚乳特異性啟動子控制下進行過量表達，結果獲得胚乳中積累八氫番茄紅素的稻米。Bramley等[4]將番茄PSY基因反義導入番茄，結果GGPP積累，而類胡蘿卜素含量大大下降，表明PSY基因在番茄類胡蘿卜素合成中起到了限速作用。PSY是番茄紅素生物合成途徑中的第一個關鍵酶，通過基因工程手段克隆其編碼基因成為基因育種改變植物中番茄紅素含量的首選目的基因。目前，番茄PSY2基因已經克隆，但尚未見到有人通過PSY2蛋白在植物果實中特異表達進而改善果實品相達到改良番茄品質的研究報道。本研究擬構建PSY2基因的番茄果實特異性啟動子植物表達載體，轉化根瘤農桿菌，為進一步轉化番茄，獲得番茄紅素含量高，且表達PSY2蛋白的番茄果實打下一個良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄（Lycopersicon esculentumcv）“華豐”品種種子由廣州市蔬菜研究所邱漫宇副研究員惠贈。大腸桿菌E.coliDH5α、農桿菌LBA4404、EHA105和植物表達載體pBI101.2由華南植物園張美實驗室提供。克隆載體質粒pMDl8-T、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、TRIzol試劑盒購自TaKaRa公司，DNA純化回收試劑盒及其他相關試劑購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.2 試驗方法

①PSY2基因和質粒pBI101.2重組載體的構建。a.PSY2基因的引物設計。根據已發表的番茄PSY2基因序列EF534739，用生物軟件DNAStar設計了該基因的上下游引物（由上海生工合成，分別命名為PSY2F,PSY2R），分別引入BamHⅠ和SacⅠ限制性酶切位點，引物序列如下。

b.RT-PCR擴增目的基因PSY2。利用Takara的試劑盒（PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2），本試驗采用王小蘭等[5]的方法提取番茄幼苗總RNA，并以此為模板進行RT-PCR反應，反應產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。

c.PSY2基因和pBI101.2的連接、篩選及鑒定。回收后的PSY2基因和pBI101.2質粒分別用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切后，切膠回收酶切后的pBI101.2質粒大片段和PSY2基因片段,通過T4 DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產物轉化到大腸桿菌E.coliDH5α菌株中,挑取Kan抗性克隆進行BamHⅠ和SacⅠ雙酶切驗證。將驗證成功的重組質粒送上海生工進行序列測定，連接正確的重組質粒命名為pBIPSY2。

②番茄E8啟動子與重組質粒pBIPSY2的連接。a.番茄E8啟動子的引物設計。根據Deikman等[6]報道的番茄Cherry種的果實特異性E8啟動子序列，用生物軟件DNAStar設計2條PCR引物，分別為 E8F：5′GCAAGCTTA GGAATTTCACGAAATCG3′引入 HindIII酶切位點；E8R：5′CGGGATCCTCTTT TGCACTGTGAATGAT3′引入BamHⅠ酶切位點。

b.PCR擴增番茄E8啟動子。采用CTAB法提取番茄基因組DNA，并以此為模板進行PCR。反應產物通過電泳檢測并切膠回收。

c.E8啟動子與克隆載體pMDT-18的連接。將pMDT-18載體與回收的E8片段16℃反應過夜，連接產物轉化E.coliDH5α，涂布在含Amp的LB培養基上，挑選單菌落于LB液體培養基中，37℃培養過夜，少量抽提質粒，用于PCR鑒定。并命名為pMDTE8。

d.E8啟動子和pBIPSY2的連接、篩選及鑒定。將構建好的pMDTE8和pBIPSY2質粒分別通過HindIII和BamHⅠ雙酶切后，切膠回收pBIPSY2質粒大片段和E8啟動子片段，通過T4 DNA連接酶16℃連接過夜。將質粒轉化到大腸桿菌E.coli DH5α菌株中，對Kan抗性克隆進行PCR驗證，將PCR驗證成功的重組質粒送上海生工進行序列測定，連接正確的重組質粒命名為pBEPSY2。

③重組質粒pBEPSY2轉化農桿菌。從大腸桿菌 E.coliDH5α菌株中提取 pBI101.2、pBEPSY2質粒，采用凍融法將其轉化入根瘤農桿菌中，挑取抗Kan和Gent的克隆，以提取的質粒為模板，進行PCR驗證。

圖1 番茄PSY2基因的RT-PCR產物電泳圖譜

圖2 pBIPSY2的PCR鑒定圖譜A及pBIPSY2的酶切鑒定圖譜B

2 結果與分析

2.1 pBIPSY2質粒的構建

①目的基因PSY2的擴增 利用引物（PSY2F和PSY2R），以番茄幼苗總RNA為模板，進行逆轉錄擴增，得到一如圖1所示的條帶特異，大小約1.5 kb的基因。

②目的片段PSY2與表達載體pBI101.2的連接 將RT-PCR擴增后得到的目的片段進行電泳、切膠回收，然后將分別用限制性內切酶BamHI和SacI完全酶切的PSY2目的片段與pBI101.2進行連接、轉化、篩選。將PSY2基因與pBI101.2質粒連接轉化后得到重組植物表達載體用引物PSY2F和PSY2R擴增，得到如圖2A所示，所挑選的克隆均擴增出約1.5 kb的產物；進一步經BamHI和SacI酶切鑒定，結果如圖2B所示，與未酶切的質粒（2B中的1號點樣孔）對比可知，酶切的載體有兩個片段，說明載體pBI101.2插入了外源片段。測序結果表明，我們插入的目的片段是一全長1 446 bp，包含一個1 224 bp完整閱讀框的PSY2基因，證明目的片段PSY2與表達載體pBI101.2連接成功。

2.2 E8啟動子與重組表達載體pBIPSY2的構建

圖3 果實特異性E8啟動子重組質粒PCR鑒定圖

①E8啟動子片段的擴增 以CTAB法提取的番茄基因組DNA為模板，PCR法擴增E8啟動子片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳,得到一個1 100 bp左右的電泳條帶，如圖3A所示，條帶清晰特異。為使接下來的克隆繼續進行，首先將擴增得到的E8啟動子與T載體進行連接，經篩選、測序后證明，擴增的序列與Deikman等[6]報道的番茄果實特異性E8啟動子序列完全一致，說明啟動子區在不同品種中是高度保守的。根據E8引物設計時加入的限制性內切酶BamHI和HindIII，將E8片段從重組T載體上切下來，與同樣經限制性內切酶BamHI和HindIII切除35S啟動子的重組植物表達載體pBIPSY2進行過夜連接，經轉化，PCR篩選，如圖3B所示，得到含有E8片段的陽性克隆，說明E8啟動子區已成功連接入植物表達載體pBIPSY2中，我們命名為pBEPSY2。將pBI101.2、pBEPSY2質粒采用凍融法分別轉化根瘤農桿菌感受態細胞，挑取抗Kan和Gent的克隆提取質粒后進行PCR驗證。保存pBI101.2和pBEPSY2質粒成功轉化的根瘤農桿菌LBA4404和 EHA105。

3 小結與討論

植物啟動子在植物發育的時空調控中有著十分重要的作用。目前，普遍應用的植物啟動子是能啟動外源基因在植物細胞中有效表達的組成型強啟動子CaMV35s，但是這類啟動子調控的基因表達既沒有組織特異性，也不受發育時期的影響，而組織特異性表達啟動子，不僅可以提高外源基因的表達量，有目的地調節轉基因植物果實的發育或種子的營養或改善其品質。E8啟動子是Lincoln等[7]于1987年發現的番茄果實特異性啟動子，它是乙烯應答性基因的啟動子，Deikman等[6]通過試驗證實-409～-263 bp可控制E8基因在果實成熟過程中特異表達。因此，選擇包含-409～-263 bp在內的1 100 bp的E8啟動子調控區進行基因表達的調控，理論上對于番茄品質的改良是可行的。事實上，已有的試驗也證明E8啟動子能引導目的基因在番茄等果實中高效地定向表達，是一種新型的果實特異性啟動子。Fraser等[8]將Erwinia uredovor的八氫番茄紅素合成酶CrtB基因導入番茄，在果實特異性啟動子的調控下，發現果實中番茄紅素較之于對照提高了1.8倍；Krasnyanski等[9]將E8啟動子與報道基因uidA相連，導入番茄中，通過對T0，T1植株果實和葉子中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的分析，發現E8控制的uidA基因只在番茄果實里表達。這些早期的試驗為今后作物類胡蘿卜素品質改良提供了良好的典范。

番茄是我國重要的果菜之一，但生態環境的改變以及城市工業進程加快，致使產區引種的番茄品種，其適應性與抗病性也每況愈下。青枯病是嚴重為害多種茄科植物的一種細菌性病害，國內外對蔬菜青枯病的防治作了大量的研究，但在抗病育種工作中，還存在著抗病性與產量、品質等優良性狀的矛盾以及抗性喪失等問題，八氫番茄紅素合成酶是植物類胡蘿卜素生物合成途徑中促進番茄紅素合成的上游的關鍵酶，從理論上說，將該酶基因從植物體內克隆出來，構建超量表達載體，再轉移到植物中去，通過基因工程的手段可以提高植物番茄紅素的含量，增加植物產品的營養品質。本研究針對廣州市農業蔬菜所獲得的對青枯病產生強抗但在番茄果實成熟后期顏色不轉變這一現象，構建果實特異表達啟動子調節的PSY2基因的表達載體，以期利用基因克隆的手段，增加番茄果實中番茄紅素的含量，改善番茄品相，為獲得商品化的抗青枯病品種奠定基礎。

[1]朱長甫，陳星，王英典.植物類胡蘿卜素生物合成及其相關基因在基因工程中的應用[J].植物生理與分子生物學學報，2004，30（6）：609-618.

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[5]王小蘭，劉順枝，姚焱，等.水稻OsWNK基因超量表達載體的構建及轉化[J].廣州大學學報：自然科學版，2009，8（4）：31-34.

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