不穩定膀胱逼尿肌中 Cajal樣間質細胞的分布△

新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科(石河子 832008)

李應龍 丁國富 王勤章* 李令勛 倪 釗 王新敏

逼尿肌不穩定(Detrusor instability,DI)又稱不穩定膀胱(Unstable bladder,USB),是在膀胱充盈時,自發的或被誘發的不能被主動抑制的逼尿肌不自主收縮。是臨床最常見的膀胱尿道功能障礙之一,與尿頻、尿急、緊迫性尿失禁等多種癥狀的產生有關,但其發病機制尚不明確。 Cajal間質細胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs)是存在于消化系統中,具有重要的起搏功能的一種特殊的間質細胞,它作為胃腸電活動的起搏者,在胃腸蠕動中起著重要的作用。 1996年,Smet和Jonavicius首先發現了在豚鼠和人逼尿肌上,存在著與ICCs在形態學及免疫學上類似的間質細胞[1]。由于該類細胞是否在膀胱中發揮其在胃腸管一樣的功能尚有待進一步證實,故膀胱 ICCs被稱為膀胱 Cajal樣間質細胞或膀胱 ICCs樣細胞,以與胃腸管 ICCs相區別。近年來,有關膀胱 ICCs樣細胞的形態和功能研究表明,膀胱 ICCs樣細胞可能具有起搏功能,與 DI的發生關系密切[2～5]。我們采用熒光免疫組織化學[6],觀察膀胱逼尿肌中 ICCs樣細胞的分布,探討其與 DI的關系?，F報告如下。

材料與方法

1 實驗對象 健康雌性豚鼠 50只,購自昆明醫學院動物中心,體重 250～ 300g,隨機分為實驗組(40只)和對照組(10只),實驗組行尿道結扎建立膀胱出口梗阻模型,對照組僅行尿道分離術而不作結扎,飼養6周后行充盈性膀胱測壓[7],確定 DI組 14只。測壓后飼養 3d,處死豚鼠,取出膀胱,小心剔除黏膜層,標本經 4%甲醛固定 20～ 40 min,4℃條件下 0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗過夜,OCT包埋,恒冷箱冰凍機切片,厚 50 μm,-20℃保存備用。

2 免疫組織化學 組織切片室溫下風干 30min,25℃ 1%牛血清蛋白液孵育 30min,加入酪氨酸蛋白激酶受體 (KIT)單克 隆抗 體 (ACK2,1∶ 100,eBIOSCIENCE公司)4℃ 48h,異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗大鼠 IgG抗體(1∶40,DAKO公司)25℃ 60min,水溶性封片劑封片,熒光顯微鏡觀察,各步驟間用 0.01mol/L PBS漂洗 3次,每次 5min,加入一抗后所有步驟避光操作。對照實驗以正常鼠血清代替一抗,或兔血清代替二抗,結果均為陰性。選取豚鼠腸壁為陽性對照,染色方法同上。每張切片取 4～5個視野,將數字化圖像儲存于計算機,實驗結束后進行圖像分析。

3 半定量分析及統計學處理 圖片用 Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化,以 KIT陽性細胞占逼尿肌組織面積百分比為變量,所有數據以均數±標準差(x-±s)表示,采用 SPSS11.0統計軟件進行 t檢驗,以 P＜0.05為有顯著性差異,P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

以下結果均以豚鼠空腸壁環形平滑肌層中 KIT陽性細胞為陽性對照(見圖 1)。

1 ICCs樣細胞的形態與分布 KIT陽性的ICCs樣細胞在對照組和 DI組豚鼠膀胱逼尿肌組織中分布一致,它們的走向與逼尿肌肌束平行,主要都分布于逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束中(見圖 2～ 3)。兩組細胞形態基本一致,呈梭形雙極細胞,表現為以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個長突起 (見圖 2～ 3)。在逼尿肌組織中可見陽性著色的肥大細胞,呈圓形,無突起,與 ICCs樣細胞的形態截然不同(見圖 4)。

2 ICCs樣細胞的數量 DI組 KIT陽性細胞數量較對照組明顯增多(見圖 2～ 3)。通過半定量分析顯示,DI組 KIT陽性細胞占逼尿肌組織面積的百分比(DI組 8.488%±3.440%)明顯大于對照組(3.324%±2.114%),經統計學分析,P＜0.01,兩組有極顯著性差異。

圖1 豚鼠空腸壁環形平滑肌層中 KIT陽性細胞為陽性對照(箭頭所示);KIT免疫熒光染色×200

圖2 對照組豚鼠逼尿肌中 KIT陽性細胞(箭頭所示)呈梭形雙極細胞,表現為以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個長突起。KIT陽性細胞走向與逼尿肌肌束平行,主要分布于逼尿肌肌束邊緣(細箭頭)和逼尿肌肌束中(粗箭頭);KIT免疫熒光染色×200

圖3 DI組豚鼠逼尿肌中 KIT陽性細胞形態與分布與對照組相似 (箭頭所示),數量較對照組明顯增多;KIT免疫熒光染色×200

圖4 逼尿肌組織中肥大細胞(箭頭所示),呈圓形,無突起,與 ICCs樣細胞的形態截然不同;KIT免疫熒光染色 ×200

討 論

逼尿肌具有和胃腸平滑肌相似的、不受神經控制的自發性肌源性興奮性,其興奮起源和調節機制目前尚不清楚。 ICCs在胃腸管興奮起源、動力產生和功能調控方面的重要作用以及逼尿肌和胃腸管平滑肌相似的生理特性,讓我們聯想到該類細胞在膀胱中存在和發揮相似功能的可能性。近年來,隨著對膀胱 ICCs樣細胞形態和功能研究的深入,ICCs樣細胞對膀胱動力的關鍵性調控作用引起了研究者們極大的關注。Mc-Closkey等[2]對新鮮分離的 ICCs樣細胞采用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標記的 Ca2+濃度變化情況,發現這些細胞具有自發性 Ca2+濃度波動,推測其在膀胱中可能具有起搏細胞樣活性。

我們曾在此之前嘗試過許多方法,如行膀胱組織石蠟切片及冰凍切片的免疫組織化學染色,均未得到很好的實驗結果。本實驗發現,對豚鼠膀胱組織采用組織冰凍切片,行 KIT免疫組織熒光染色的方法能較好地顯示出 KIT陽性的膀胱 ICCs樣細胞,是研究膀胱ICCs樣細胞的可靠方法。本研究發現,對豚鼠膀胱組織采用組織冰凍切片,行 KIT免疫組織熒光染色的方法能較好地顯示出 KIT陽性的膀胱 ICCs樣細胞,是研究膀胱 ICCs樣細胞的可靠方法。本研究結果顯示的KIT陽性細胞主要分布于豚鼠逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束中,而國外報道主要分布于豚鼠逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束間結締組織中[8],這種差別除豚鼠種族的原因外,可能與標本的處理,抗體的選擇以及方法有關,需要更大規模的調查證實。在膀胱中,對 KIT陽性的細胞除 ICCs樣細胞外,還有肥大細胞,但肥大細胞胞體呈圓形,無突起,與 ICCs樣細胞極易區別。

與對照組相比,DI組逼尿肌中 ICCs樣細胞數量明顯增加,形態和分布上未見明顯變化。這與國外報道的膀胱過度活動癥患者逼尿肌中,ICCs樣細胞數量明顯增加的結果相似[9]。膀胱 ICCs樣細胞與神經干和神經節連接緊密[8],而 KIT受體抑制劑甲磺酸伊馬替尼可明顯抑制正常豚鼠和 DI患者離體膀胱逼尿肌肌條的自發興奮性,并可提高豚鼠膀胱的膀胱容量和膀胱順應性[9,10],提示 ICCs樣細胞與膀胱逼尿肌興奮的起源和調控有密切的關系,可能就是膀胱的起博細胞。

綜上所述,DI逼尿肌中 ICCs樣細胞數量明顯增加,可能增加了逼尿肌自身興奮收縮性能,擾亂了神經系統與逼尿肌間的信息傳遞,進而導致了逼尿肌自發收縮活動增加,膀胱收縮功能發生紊亂。本研究結果表明膀胱中 ICCs樣細胞數量的增多,可能是引起 DI產生的原因之一,ICCs樣細胞可能就是理論上存在于膀胱的起博細胞。本研究結果為研究 DI發生機制及臨床治療膀胱功能障礙提供了新的依據。

[1]Smet PJ,Jonavicius J,Marshall VR,et al.Distribution of nitric oxide synthase- immunoreactive erves and identification of the cellular targets of nitric oxide in guinea-pig and human urinary bladder by cGM P immunohistochemistry[J].Neuroscience,1996,71(2):337-348.

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