3種有機磷農藥對黑鯛幼魚的急性毒性研究

劉祖毅，王志錚，呂敢堂，邵國洱，包堅敏

（1.嵊泗縣海洋與漁業局，浙江嵊泗 202450；2.浙江海洋學院水產學院，浙江舟山 316004；3.舟山市三鑫水產養殖有限公司，浙江岱山 316200；4.岱山縣海洋與漁業局，浙江岱山 316200）

農藥作為一類常見的環境污染物，是水域環境安全評價的重要監測對象，同時，其對水生經濟動物的影響是生態毒理研究的重要內容之一。在當前食品安全和生態安全備受關注和重視的大背景下，如何有效規避和遏制因農藥使用與管理失控而引發的一系列水域環境污染和生物生理受損等現實問題，以達到合理有效控制水域中農藥限量水平的目的，已成為保護與改善水域環境，保障水生生物生態安全的重要命題之一。

黑鯛Acanthopagrus schlegel俗稱黑加吉、銅盆魚等，隸屬于鱸形目、鯛科、鯛屬。因其具營養經濟價值高，生長快，食性雜，溫、鹽適應性廣，抗病力強和易于飼養等特點，自20世紀80年代人工育苗技術獲得產業化突破以來，一直是我國沿海重要的海水養殖魚類之一。近期國內外關于黑鯛生態毒理學方面的研究較活躍，但所涉及的毒物僅為常見重金屬離子[1，2]和常用消毒劑[3，4]，有關農藥對其存活的影響迄今尚未見報道。鑒于此，筆者于2008年7-8月在舟山市三鑫水產養殖有限公司內開展了乙酰甲胺磷、辛硫磷、三唑磷等3種常見有機磷農藥對黑鯛幼魚的急性致毒效應研究，以期為黑鯛逆境生理生態研究積累相關資料，為海水養殖環境的生態風險評估與管理以及相關漁業污染事故處理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究所用黑鯛幼魚由舟山市三鑫水產養殖有限公司提供，選取反應靈敏、無傷病、規格相近的健壯個體作為實驗對象（具體規格為體長 5.09±0.71 cm、體重 2.09±0.66 g），在室內育苗水泥池馴養 3～4 d 后備用。

1.1.2 試劑

乙酰甲胺磷（有效成分及含量：O，S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，30%）購自湖北沙隆達股份有限公司，辛硫磷乳油[有效成分及含量：O，O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，40%]購自山東勝邦魯南農藥有限公司，三唑磷乳油[有效成分及含量：O，O-二乙基-O-(1-苯基-l，2，4-三唑-3-基)硫代磷酸酯，20%]購自福建省建甌福農化工有限公司。實驗時用蒸餾水將各實驗藥物配成一定質量濃度母液，現配現用。

1.1.3 理化條件

實驗用海水為經 48 h 暗沉淀、二級沙濾處理的自然海水，水溫 27.2～30.4 ℃，鹽度 27～29，pH 8.24，水質符合漁業水質標準(GB 11607-1989)。

1.2 試驗方法

經預備實驗，確定各實驗藥物質量濃度范圍（96 h全活質量濃度上限和96 h全致死質量濃度下限）后，在室溫條件下，以自然狀態為對照，以規格60 cm×80 cm×60 cm的白色PVC水箱為實驗容器（實驗實際容積為20 L），按等差間距法設置若干質量濃度梯度組，采用靜水停食實驗法，開展單一藥物對黑鯛幼魚的急性毒性實驗。每一質量濃度梯度各放實驗動物10尾，組內設3個重復，連續觀察受試對象的活動狀況，以多次用鑷子碰觸魚體表面完全無反應作為死亡判斷標準，及時取出死亡個體，每24 h換液并統計1次總體平均死亡率。為減少實驗容器對農藥的吸附，實驗前用對應的藥物質量濃度浸泡24 h以上。

1.3 數據處理

根據實驗藥物對黑鯛幼魚的急性毒性實驗結果，借助SPSS17.0分別建立24 h、48 h、72 h和96 h 4個不同觀察時段的死亡概率單位—質量濃度直線回歸方程，采用r相關系數（P＜0.05為顯著水平）和F值（P＜0.05為顯著水平）檢驗該方程的可靠性，并應用藥物毒性蓄積程度系數MAC分析生物體對實驗藥物的蓄積與降減動態[5]。各實驗藥物的安全質量濃度計算公式如下：

式中，SC為安全質量濃度值，96 h LC50為黑鯛幼魚染毒96 h后的半致死質量濃度值[6]。

2 結果與分析

2.1 中毒癥狀

觀察發現，黑鯛幼魚不僅在農藥不同實驗質量濃度下表現出不同的中毒反應，而且其對不同種農藥的耐受力也存在明顯差異。實驗初期，低質量濃度組的幼魚活動狀況與對照組基本相似，集群于實驗容器中部水層緩慢游動，48 h內各實驗藥物低質量濃度組幼魚絕大多數個體活動狀況幾無變化，死亡個體極少；高濃度組幼魚放入實驗容器后即顯不安，在實驗容器中快速游動，24 h內部分個體呼吸變得急促并伴有浮頭現象，對外界刺激反應也變得較為遲鈍，活力明顯弱于低質量濃度組，其中乙酰甲胺磷高濃度組幼魚死亡率明顯高于辛硫磷和三唑磷達40%以上。隨著實驗時間的進一步延長，各實驗梯度組死亡個體不斷增多。黑鯛幼魚的中毒死亡過程表現為：呼吸短促，鰓絲充血，魚體上浮，繼而胸鰭和腹鰭根部變紅，尾鰭、腹鰭彎曲，魚體失衡“倒掛”，最后靜臥于實驗容器底部直至死亡。

2.2 農藥對黑鯛幼魚的急性毒性效應

由表1可見，隨著實驗質量濃度的提高和實驗時間的延長，3種有機磷農藥對黑鯛幼魚的急性毒性效應均明顯增強，死亡率也明顯升高，但不同實驗藥物對黑鯛幼魚的急性毒性影響卻不盡相同，主要表現為：（1）致死陡度不同。各實驗藥物質量濃度梯度組間對黑鯛幼魚的致死陡度隨觀察時段的推移而變化，按時序依次表現為：乙酰甲胺磷＞三唑磷＞辛硫磷（0～24 h）、乙酰甲胺磷＞三唑磷≈辛硫磷（24～48 h）、辛硫磷＞三唑磷≈乙酰甲胺磷（48～72 h）及辛硫磷≈三唑磷＞乙酰甲胺磷（72～96 h）；（2）死亡率增速不同。在實驗質量濃度范圍內，隨染毒時間的延長，各實驗藥物高質量濃度梯度組（96 h死亡率＞50%）間，死亡率增速依次呈現為：辛硫磷＜乙酰甲胺磷＜三唑磷（0～24 h）、三唑磷＜辛硫磷＜乙酰甲胺磷（24～48 h）、乙酰甲胺磷＜三唑磷＜辛硫磷（48～96 h），而低質量濃度梯度組（96 h死亡率≤50%）間則幾無差異；（3）毒性強度不同。從實驗質量濃度范圍以及不同觀察時段對黑鯛幼魚的急性毒性結果來看，三唑磷毒性強度為最大，辛硫磷次之，乙酰甲胺磷最低，其中三唑磷毒性強度分別約為辛硫磷的10倍和乙酰甲胺磷的300倍。

表1 不同觀察時段3種有機磷農藥對黑鯛幼魚的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of three common pesticides on Trionyx sinensis juveniles at intervals of time at different dose

3 討論

3.1 乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷對對黑鯛幼魚的急性致毒效應特征

魚類乙酰膽堿酯酶(AchE)主要存在于神經組織和血細胞中，乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷均屬以觸殺和胃毒作用為主的有機磷農藥，它們引起魚類中毒的機制主要是通過對AchE活性中心的絲氨酸進行羥基磷酸化，抑制AchE活性，造成體內乙酰膽堿大量蓄積，運動神經傳遞受阻來實現的。同時研究也表明，干擾諸如線粒體呼吸、碳水化合物代謝、蛋白質合成等一系列生化過程也是有機磷農藥對魚類誘毒的分子機制之一[7]。

從實驗中毒癥狀來看，黑鯛幼魚對有機磷農藥中毒致死過程依次由呼吸短促，鰓絲充血，繼而胸鰭和腹鰭根部變紅，尾鰭、腹鰭彎曲，魚體失衡“倒掛”，最后靜臥于實驗容器底部直至死亡來完成的。本研究認為其中毒過程是由農藥在體內不斷蓄積致使運動神經傳遞受阻和生化過程受擾共同引發所致。

農藥分子結構與致毒機制的差異，以及實驗生物間生理與代謝特征的差別，必然導致實驗生物對各種農藥表現不同的耐毒能力。從本研究來看，在染毒96 h后死亡率相近的組別中（以死亡率50%為例，見表1），黑鯛幼魚致死率增加值隨觀察時段依次呈現為三唑磷＞乙酰甲胺磷=辛硫磷（0～24 h）、三唑磷＞辛硫磷＞乙酰甲胺磷（24～48 h）、乙酰甲胺磷＞三唑磷=辛硫磷（48～72 h）和辛硫磷＞三唑磷=乙酰甲胺磷（72～96 h），表明在相同急性毒性水平下，三唑磷、辛硫磷和乙酰甲胺磷在黑鯛幼魚體內的侵入和蓄積速率的高低在時序上存在明顯的階段性差異，即三唑磷、乙酰甲胺磷和辛硫磷分別在實驗早、中、后期具較強的毒發效應。乙酰甲胺磷作為甲胺磷的N-乙酰基衍生物，本研究中其毒性明顯弱于三唑磷的情形已在對厚殼貽貝Mytilus coruscus幼貝[8]、麥瑞加拉鯪魚Cirrhinus mrigala幼魚[9]、婆羅異劍水蚤Apocyclops borneoensis和日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus[10]的研究中得到證實，其毒性強度低于三唑磷和辛硫磷的結果也與SULTAATOS等得出的二甲基硫代磷酸酯（乙酰甲胺磷）可被生物體內谷胱甘肽—S—轉化酶（GSTs）轉甲基而脫毒，而乙基硫代磷酸酯（三唑磷、辛硫磷）分子較大阻礙了這種轉化使毒性明顯增強的結論[11]相吻，至于本研究中辛硫磷毒性明顯弱于三唑磷的結果是否為(1-苯基-l，2，4-三唑-3-基)基團較(苯乙腈酮肟)基團與AchE具更強的親和力所致尚待進一步驗證。同樣，關于乙酰甲胺磷對鯽魚、鯉魚和鰱魚的毒性強度與辛硫磷相近[12]的報道與本研究結果相悖的原因也有待進一步深入研究。

3.2 乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷對黑鯛幼魚的急性致毒效應和蓄積與降減特征

對表1數據作統計學處理得表2。由表2可見，3種農藥在相同實驗時間條件下，不同實驗質量濃度梯度組的致死效果存在顯著差異，通過建立死亡概率單位—質量濃度回歸方程，均顯示出較好的擬合度（r＞r0.05；另除辛硫磷 0～24 h、乙酰甲胺磷 24～48 h 時段外，F 均大于 F0.05），表明黑鯛幼魚受農藥脅迫下的致死率與其實驗質量濃度密切相關。

表2 不同觀察時段3種常見農藥對黑鯛幼魚急性毒性特征的分析Tab.2 Analysis of feature of the acute toxicity of three common pesticides on Trionyx sinensis juveniles at intervals of time at different dose

毒物在生物體內的蓄積與降減情形是評價毒物毒效和分析生物耐毒能力的基礎。由表2可見，乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷MAC值均為正值，表明它們在黑鯛幼魚體內蓄積作用較降解作用而言，一直處于優勢地位。但因農藥分子結構與致毒機制的差異，致使其MAC值的變化不盡一致。乙酰甲胺磷和三唑磷MAC值隨實驗時間延長而梯次減少，表明乙酰甲胺磷和三唑磷在實驗早、中期就表露出極強的蓄積作用，并表露死亡高峰，同時也為后續死亡率的明顯上升奠定了基礎；辛硫磷MAC值在48～72 h時段最大高達75.00，24～48 h時段最小僅為5.00，表明實驗早期黑鯛幼魚對辛硫磷有較強的降減能力，至48 h后這種降減能力迅速減弱，毒物蓄積作用明顯占據優勢，并于48～72 h時段表露死亡高峰，72 h后蓄積作用逐漸減弱，致死壓力繼續增強。以上分析與表1和表2結果一致。

3.3 關于黑鯛幼魚對乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷安全濃度的評價

由表2可見，乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷對黑鯛幼魚半致死質量濃度96 h LC50值依次為14.07 mg/L、0.30 mg/L和0.051 mg/L，按農藥對魚類的毒性等級標準評價[13]，乙酰甲胺磷對黑鯛幼魚屬低毒，三唑磷和辛硫磷均屬高毒。將乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷對黑鯛幼魚的安全質量濃度（依次為1.41 mg/L、0.03 mg/L和0.005 mg/L）與我國漁業水質標準（GB11607-1989）規定的甲胺磷（O，S-二甲基硫代磷酰胺）、馬拉硫磷[二硫代磷酸O，O-二甲基-S-（1，2-二乙酯基乙基）酯]和甲基對硫磷（硫代磷酸-O，O-二甲基-O-對硝基苯基酯）高限（依次為1 mg/L、0.005 mg/L和0.000 5 mg/L）相較[10]，表明黑鯛幼魚對乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷都具較強的敏感性，故應加強養殖水體中乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷含量的監控工作，確保其生存安全。

致謝：蒙舟山市三鑫水產養殖有限公司提供實驗場地和部分試驗用具，本校2005級水產養殖專業陳勇強、陳呂力、李俊華、胡虹菲等同學參與本研究部分實驗工作，謹表謝忱！

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