離子液體微波輔助萃取金銀花中綠原酸的研究

李慶龍，曲有樂(lè)，歐陽(yáng)小琨

(1.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

離子液體是在室溫及相鄰溫度下完全由離子組成的有機(jī)液體熔融鹽[1，2]，具有蒸汽壓低、揮發(fā)性小、溶解能力強(qiáng)、萃取能力好、液態(tài)范圍寬等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，對(duì)微波具有強(qiáng)的吸收和熱轉(zhuǎn)換能力。離子液體作為一種可設(shè)計(jì)的綠色溶劑廣泛應(yīng)用在液/液萃取、液相微萃取、固相微萃取、雙水相萃取。離子液體與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比，具有熱穩(wěn)定性好、不爆炸、不易燃燒、不揮發(fā)、便于重復(fù)利用的特點(diǎn)[3-5]。以離子液體作為溶劑，可以減少在萃取過(guò)程中的環(huán)境污染。

微波萃取技術(shù)(MAE)具有萃取速度快、產(chǎn)率高、安全無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，將微波萃取技術(shù)和離子液體結(jié)合起來(lái)，形成了一種新型的萃取方法應(yīng)用于萃取分離領(lǐng)域，使其具有二者各自的優(yōu)點(diǎn)，可達(dá)到理想的萃取分離目的。杜甫佑等[6-8]以離子液體溶液為溶劑，研究了離子液體微波輔助萃取石蒜中石蒜堿、力克拉敏和加蘭他敏生物堿，并與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑和傳統(tǒng)萃取技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果顯示本方法快速高效、環(huán)境友好。本文在有機(jī)溶劑MAE萃取綠原酸的研究工作基礎(chǔ)上，以離子液體溶液為溶劑，微波輔助萃取金銀花的綠原酸，并與傳統(tǒng)萃取方法進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；金銀花（購(gòu)于舟山市芝林大藥房）。

1.2 試劑與儀器

溴代正丁烷（化學(xué)純），乙腈（色譜純），其余所用試劑均為分析純。

DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Feb85-2恒溫磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1004N電子天平（上海民橋精密科技儀器有限公司）；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（河南省太康科教器材廠）；XH-100A電腦微波催化合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；800B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；伊利特1201高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑的預(yù)處理

1-甲基咪唑：加入KOH干燥24 h，130℃下減壓蒸餾出1-甲基咪唑；正溴丁烷：加入CaCl2干燥24 h，70℃下減壓蒸餾出正溴丁烷；硝酸銀（AR）溶液：在避光條件下稱(chēng)重1.019 2 g的AgNO3，用去離子水溶解，然后稀釋至100 mL于棕色瓶中保存，備用。

1.3.2 中間體 1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br）的制備

反應(yīng)式如圖1所示。取重蒸的1-甲基咪唑和溴丁烷各0.5 mol至于500 mL圓底燒瓶中，油浴加熱并進(jìn)行攪拌，調(diào)節(jié)加熱功率使加熱油的溫度在10 min中內(nèi)從室溫升到140℃，燒瓶?jī)?nèi)生成白色乳狀物，當(dāng)白色乳狀物消失后溶液變?yōu)榻瘘S色，撤去油浴鍋繼續(xù)攪拌，溫度降至室溫再置于140℃油浴下反應(yīng)15 min[9]，得到金黃色液體[Bmim]Br，生成物用二氯甲烷溶解，活性炭脫色純化2～3次，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，在398 K（125℃）下真空干燥12 h后取出，底層析出白色針狀晶體，用活性炭脫色后得率為86.8%。

圖1 [Bmim]Br的反應(yīng)歷程Fig.1 Scheme of[Bmim]Br

1.3.3 [Bmim]BF4的制備

反應(yīng)式如圖2所示。取中間體0.1 mol[Bmim]Br和 0.11 mol NaBF4，加入到250 mL錐形瓶中，以丙酮作溶劑，在磁力攪拌下室溫反應(yīng)24 h，真空抽濾反應(yīng)液，除去生成的NaBr，然后減壓蒸餾出濾液中的丙酮后，加入二氯甲烷，進(jìn)一步析出白色固體NaBr，真空抽濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾出二氯甲烷，重復(fù)操作2～3次，直到?jīng)]有白色固體(NaBr)析出為止，將產(chǎn)物置于真空干燥箱，70℃干燥至無(wú)失重，得無(wú)色粘稠液體[Bmim]PF4，得率為90.1%。

圖2 [Bmim]BF4的反應(yīng)歷程Fig.2 Scheme of[Bmim]BF4

2 結(jié)果與討論

2.1 [Bmim]BF4的表征

2.1.1 紅外圖譜解析

對(duì)[Bmim]BF4離子液體進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，測(cè)定波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。3 161～3 170 cm-1是咪唑環(huán)上的C-H伸縮振動(dòng)峰；2 967～2 968 cm-1是咪唑側(cè)鏈上CH3-和-CH2-的伸縮振動(dòng)峰；1 465～1 574 cm-1是咪唑環(huán)的骨架振動(dòng)；1 169～1 167 cm-1是咪唑環(huán)C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；1 047 cm-1是B-F的伸縮振動(dòng)峰。圖譜顯示的特征與文獻(xiàn)[10]一致。

2.1.2 核磁圖譜解析

以CDCl3為溶劑對(duì)[Bmim]BF4進(jìn)行核磁共振氫譜分析。核磁共振主要數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)Tab.1 Data of NMR-H1

在δppm=0.95處積分面積為3.02的三重峰，表明有3個(gè)質(zhì)子，是正丁基末端的甲基；在δppm=1.38處積分面積為2.05的六重峰，表明有2個(gè)質(zhì)子，為正丁基上甲基旁邊的亞甲基；在δppm=1.86處積分面積為2.1的五重峰，表明有2個(gè)質(zhì)子，為與氮相連正丁基上的亞甲基2個(gè)氫，受到旁邊4個(gè)氫的作用分裂成五重峰。在δppm=3.9處有個(gè)積分面積為3.05的單峰，表明有3個(gè)質(zhì)子，證明為與氮相連的甲基，化學(xué)位移比正丁基上的甲基高；δppm=4.20處有個(gè)面積為2.0的三重峰，表明有2個(gè)質(zhì)子，證明為與氮相連的亞甲基上的2 個(gè)氫；在 δppm=7.34 和 δppm=7.26 兩處有 2 個(gè)峰，積分面積分別為 0.98 和 0.99，推定為咪唑環(huán)上的另外2個(gè)氫，由于它們處在相似的化學(xué)環(huán)境下，所以具有相近的化學(xué)位移值；在δppm=9.0處有一個(gè)單峰，積分面積為1.00，表明此處為單個(gè)質(zhì)子，咪唑環(huán)上2個(gè)氮原子之間碳上相連的氫符合此條件。綜合以上分析，可以確定此譜圖為1-甲基-3-丁基咪唑陽(yáng)離子，陰離子為BF4-離子，對(duì)氫譜沒(méi)有影響。

2.2 [Bmim]BF4水溶液微波輔助萃取金銀花中綠原酸

2.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸(1∶9)，檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm，柱溫：室溫，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL。在選定的色譜條件下，金銀花提取液中的綠原酸峰對(duì)稱(chēng)性好，并可以與其它組分達(dá)到基線(xiàn)分離。

2.2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加4 mL甲醇（AR），制成2.5 mg/mL的母液，吸取母液分別配制成濃度為：0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL 的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，按照 2.2.1 的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以綠原酸的濃度（x，mg/mL）與峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=12 634 x-185.57(R2=0.995)。

2.2.3 萃取條件優(yōu)化

2.2.3.1 萃取溶劑篩選

分別準(zhǔn)確量取15 mL的水、V水：V[Bmim]BF4=11:4的離子液體、50%甲醇和50%乙醇各1份，將準(zhǔn)確稱(chēng)取的1 g金銀花粉末加到各自溶劑中，在900 W、70℃微波輔助條件下分別萃取5 min，離心10 min，分別取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。不同萃取溶劑萃取綠原酸的得率如圖3所示。

圖3 不同溶劑對(duì)綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of different solvents on yield of chlorogenic acid

從圖3中各種溶劑提取綠原酸可知，對(duì)比純水做溶劑，離子液體溶液的加入影響金銀花中綠原酸的萃取得率，高于水（2.78%），高于 50%乙醇溶液（6.25%），高于 50%甲醇（3.5%），并且由高效液相色譜圖可知，利用離子液體溶液萃取所得雜質(zhì)最少，其他溶劑萃取綠原酸的峰面積小于或接近離子液體萃取的峰面積，但經(jīng)萃取獲得的雜質(zhì)明顯較多。甲醇有毒易揮發(fā)污染環(huán)境，對(duì)人的健康造成危害。離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成的有機(jī)鹽，對(duì)微波具有強(qiáng)吸收和轉(zhuǎn)化能力，能有效提高離子液體溶液對(duì)微波的吸收和轉(zhuǎn)化，使溶劑和樣品迅速升溫，快速萃取樣品中的綠原酸。因此本文選擇[Bmim]BF4的水溶液為萃取劑萃取金銀花中的綠原酸。

2.2.3.2 V[Bmim]BF4水溶液體積比的優(yōu)化

分別配置15 mL的水和[Bmim]BF4的混合萃取溶劑5份，水和[Bmim]BF4的體積比分別為：14:1、13:2、12:3、11:4、10:5，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g金銀花粉末加到5份混合萃取溶劑中，在900 W、70℃微波輔助條件下萃取5 min，萃取液離心10 min，分別取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。不同體積比的離子液體/水萃取綠原酸的得率如圖4所示。

由圖4可以得出，當(dāng)V[Bmim]BF4/V水從1/14增加到4/11時(shí)，綠原酸的得率增加了10%。再將V[Bmim]BF4/V水從4/11增加到5/10時(shí)，綠原酸的得率下降了4.2%，其主要原因是：當(dāng)V[Bmim]BF4/V水為4/11時(shí)，離子液體溶液將綠原酸從樣品中基本萃取完全，得率達(dá)到最大值(1.43%)，當(dāng)加大V[Bmim]BF4/V水時(shí)，樣品中殘留的綠原酸很難被萃取出來(lái)，并且由于離子液體的增加，使溶液的粘度增大、擴(kuò)散能力變差，溶液更難滲入到樣品基質(zhì)的內(nèi)部，導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇V[Bmim]BF4/V水比4/11為提取金銀花中綠原酸的萃取溶劑。

圖4 水和[Bmim]BF4體積比對(duì)綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of different of V[Bmim]BF4/Vwateron yield of chlorogenic acid

2.2.3.3 微波萃取功率的優(yōu)化

配置15 mL體積比為11：4的水和[Bmim]BF4混合萃取溶劑5份，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g金銀花粉末加到5份混合萃取溶劑中，在70℃萃取功率分別為900 W、800 W、700 W、600 W、500 W微波輔助萃取5 min，萃取液離心10 min，分別取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。不同功率萃取綠原酸的得率如圖5所示。

從圖5可以看出，當(dāng)功率從500 W增加到600 W時(shí)，綠原酸提取率增加，在功率600 W時(shí)，達(dá)到最大值（1.43%），綠原酸的提取率隨微波功率的增大而增加；當(dāng)功率超過(guò)600 W后，提取率開(kāi)始下降，由于離子液體溶液吸收微波的能力較強(qiáng)，因此用小功率即可將樣品中的綠原酸萃取完全，功率過(guò)大使綠原酸降解，并且浪費(fèi)能源，增加了成本。因此本實(shí)驗(yàn)最優(yōu)的提取功率為600 W。

圖5 微波功率對(duì)綠原酸得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on yield of chlorogenic acid

2.2.3.4 萃取時(shí)間的優(yōu)化

配置15 mL體積比為11:4的水和 [Bmim]BF4混合萃取溶劑5份，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g金銀花粉末加到5份混合萃取溶劑中，在600 W、70℃微波輔助條件下分別萃取 3 min、5 min、7 min、9 min、11 min，離心 10 min，分別取上清液用HPLC檢測(cè)綠原酸的收率。不同萃取時(shí)間所得綠原酸的得率如圖6所示。

由于微波輔助萃取技術(shù)具有加熱快速高效的特點(diǎn)，一般在10 min內(nèi)萃取完樣品中的目標(biāo)物。從圖6可知，萃取時(shí)間從3～9 min，綠原酸得率一直增加，在9 min得率達(dá)到最大值(1.475%)，提取超過(guò)9 min后，提取率下降，因?yàn)檩腿r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，綠原酸可能被降解。因此，本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)萃取時(shí)間為9 min。

圖6 萃取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on yield of chlorogenic acid

4 結(jié)論

(1)本文合成了[Bmim]BF4離子液體，采用微波輔助萃取技術(shù)從金銀花中提取綠原酸。利用微波萃取快速、離子液體綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，將兩者結(jié)合起來(lái)，提出具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的萃取方法，該法可以用于金銀花中綠原酸的快速高效萃取。

(2)對(duì)離子液體微波輔助萃取金銀花中綠原酸的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并與傳統(tǒng)溶劑提取進(jìn)行了比較，離子液體溶液作為萃取劑比常規(guī)溶劑萃取效率高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于天然活性成分的提取有較好的參考價(jià)值。

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