微波輔助萃取-分光光度法測定加拿大一枝黃花中總黃酮

曲有樂，于春光，王 斌，楊立業

（1.浙江海洋學院食品與藥學學院、醫學院，浙江舟山 316004；2.佳木斯大學化學與藥學院，黑龍江佳木斯 154007）

加拿大一枝黃花Solidago canadensis L為菊科Compositae一枝黃花屬Solidago植物，原產北美，為《歐洲藥典》收錄傳統藥用植物，應用于糖尿病、慢性腎病、風濕病、尿結石、泌尿疾病和消炎鎮痛治療[1]。近年來，本種在我國華東、華北、華南等地大面積爆發性生長，對我國的生態環境構成了嚴重威脅[2，3]。已有的研究表明，加拿大一枝黃花富含黃酮、多炔、萜類、皂苷等成分[4-8]，特別是總黃酮含量高達11%[9]。黃酮類成分能有效減輕細胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質的過氧化，預防和治療多種疾病[10，11]。如能以加拿大一枝黃花為原料，進行黃酮類成分的開發，即可變廢為寶，又可有效地控制其蔓延。但是，目前未見加拿大一枝黃花總黃酮提取工藝的報道。

與傳統的索氏提取法、超聲波提取法和浸提法比較，微波輔助萃取技術利用微波對細胞的破壁作用和加熱作用，可使細胞內有效成分快速溶出，具有操作簡便、經濟可靠、重現性好等特點，在中藥活性成分，特別是黃酮類成分的提取中得到了較多的應用[12]。

為此，本實驗采用微波輔助萃取-分光光度法進行拿大一枝黃花總黃酮的提取和分析，并對其不同部位的總黃酮進行比較，結果表明該法快捷、易控，將為加拿大一枝黃花資源的合理利用提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用加拿大一枝黃花于2008年10月盛花期采自浙江省舟山市定海區郊區，粉碎、過60目篩得藥材粉末待用。標本存放于浙江海洋學院食品與藥學學院生藥學實驗室。

1.2 儀器與試劑

XH-100A型微波催化合成萃取儀（北京祥鴿科技發展有限公司）；722型可見光分光光度計（上海精密科技有限公司）；SK5200H超聲波清洗器（上海科技超聲儀器有限公司生產）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

蘆丁（中國藥品生物制品檢定所提供）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚均為分析純，實驗用水為去離子水。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的處理

準確稱取5 g樣品于四頸燒瓶中，按要求加入一定量的乙醇，控制一定醇濃度，在一定的微波功率下微波萃取一定時間，抽濾，定容，取一定量萃取液進行顯色、測定。

1.3.2 總黃酮含量的測定[13，14]

取少量萃取液加入到10 mL容量瓶中，依次加入若干毫升的NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液后，用乙醇溶液定容至10 mL，于室溫下放置10 min。用1 cm比色皿，以試劑空白為參比，在選定波長下測定其吸光度。根據標準曲線求得總黃酮的提取率，其計算公式為：

總黃酮的提取率 =（c×V·M-1）×100%

其中c為溶液中蘆丁的濃度(μg/mL)，V為萃取液總體積，M為加拿大一枝黃花的質量。

2 結果與討論

2.1 測定波長的選擇

取適量總黃酮萃取液進行顯色反應，用分光光度計對其產物在400～700 nm之間掃描，在510 nm處有最大吸收，所以確定510 nm為測定波長。

2.2 標準曲線的建立

精確稱取蘆丁標準品 10 mg，用 60%乙醇溶液定容至 100 mL，4 ℃冷藏。分別取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標準液于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀釋成5.0 mL。加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%的 Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置6 min；加4%的NaOH溶液2.0 mL，用水稀釋至刻度，放置10 min，在分光光度計上，以試劑空白為參比于510 nm處測其吸光度，得到回歸方程為 A=0.844 c+0.006 1(r=0.999 4)，式中 A為吸光度，c為溶液中蘆丁的濃度(μg/mL)，該方程在所測范圍內(10～50 μg/mL)線性關系良好。

2.3 微波輔助萃取法的單因素試驗

2.3.1 液固比對黃酮提取率的影響

在其他條件相同時，考察了不同液固比微波萃取加拿大一枝黃花中黃酮類物質提取率的影響，結果如圖1所示。圖1結果表明提取率隨著液固比的增大而呈上升趨勢，但增大到一定程度后就趨于下降，實驗中選擇液固比為30∶1～50∶1。

圖1 液固比對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of solution to solid on extraction yield

2.3.2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

本文用乙醇溶液作為提取體系，考察了乙醇濃度對微波萃取加拿大一枝黃花中黃酮類物質提取率的影響，結果如圖2所示。圖2結果表明黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而增加。因此考慮選50%～70%乙醇作提取劑為宜。

2.3.3 微波功率對黃酮提取率的影響

在其他條件相同時，考察了微波功率對微波萃取加拿大一枝黃花中黃酮類物質提取率的影響，結果如圖3所示。圖3結果表明提取率隨微波輻射功率的增加而呈現先增加后下降的趨勢。因此實驗中微波功率最好控在500～700 W之間。

2.3.4 微波輔助提取時間對黃酮提取率的影響

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of concentration of ethanol on extraction yield

圖3 微波功率對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction yield

在其他條件相同時，考察了微波輔助提取時間對微波萃取加拿大一枝黃花中黃酮類物質提取率的影響，結果如圖4所示。圖4結果表明提取率隨微波輻射時間的增加而呈現先增加后下降的趨勢。從時間效益考慮，微波時間應控制在10～20 min。

圖4 微波輔助提取時間對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of microwave time on extraction yield

2.4 正交實驗確定微波輔助提取的最佳條件

以上討論了各單因素的影響，但在實際操作中，各因素之間相互交叉影響。因此，為了全面考察影響因素，選擇L9(34)正交表，以微波功率、乙醇濃度、微波時間、液固比為4因素，做3水平的正交實驗,結果見表1。

由表1可知：計算分析所得的最佳提取條件為A3B3C1D2。即在樣品中加入50%乙醇溶液，控制液固比為40∶1，在700 W微波功率下微波輻射20 min。極差值反映的因子影響順序為 D(液固比)＞ A(微波功率)＞ C(乙醇濃度)＞B(微波時間)，即乙醇濃度對提取率的影響最大。

表1 正交實驗確定微波輔助提取的最佳條件Tab.1 Effects of different microwave extraction factors on the extraction yield of total flavones

2.5 最佳條件下的重現性和回收率實驗

2.5.1 重現性實驗

取同一批加拿大一枝黃花樣品5份，在最佳條件下進行萃取，分別測定各自的總黃酮含量，結果表明其相對標準偏差為1.68%。

2.5.2 加入回收率實驗

準確稱取一定量樣品3份，加入不同量的蘆丁對照品溶液在微波條件下進行萃取，萃取物按實驗方法進行顯色，測定吸光度，計算回收率，結果表明回收率在97.6%～101.0%之間，說明此方法有較好的準確度。

2.6 加拿大一枝黃花各部位黃酮類化合物含量的比較

采用最佳提取工藝對一枝黃花根、莖、葉、花4個部位黃酮類化合物的含量進行比較，結果見表2。由表2可知，黃酮含量順序為葉＞花＞根＞莖；與一枝黃花地上部分比較發現，加拿大一枝黃花地上部分黃酮含量明顯高于地下部分。

表2 加拿大一枝黃花各部位黃酮類化合物含量的比較Tab.2 Analytical results of the position

2.7 提取方法對黃酮提取率的影響

取同一批樣品4份，根據最佳提取條件分別進行微波輔助萃取，超聲提取，索氏提取，用分光光度法測定3種提取方法的提取率，結果見表3。由表3可知：微波輔助萃取法的提取效率高于其他兩種方法，且既節省時間，又節省試劑。

表3 提取方法對黃酮提取率的影響Tab.3 Analytical results of the samples

3 結論

本文主要對微波輔助萃取法萃取加拿大一枝黃花中總黃酮進行了初步研究，由重現性實驗和加入回收實驗的結果可以看出，本實驗建立的萃取方法和測定方法可靠、準確、簡便。微波輔助萃取、超聲波萃取與索氏提取法的比較表明，微波輔助萃取法具有快速、提取率高、溶劑用量少等特點，適用于傳統中草藥中黃酮類物質含量的測定。

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