海帶抗氧化多酚的制備及活性研究

徐銀峰，于春光，王 斌，羅紅宇

（浙江海洋學院食品與藥學學院、醫學院，浙江舟山 316004）

抗氧化劑是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質，其不僅可以能夠防止油脂和食品氧化延長保質期，而且還有許多防病保健功能[1]。因此，抗氧化劑廣泛用于食品工業，需求量逐年增加。由于合成抗氧化劑如植物酸（BHA）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）和特丁基對苯二酚（TBHQ）等的毒性問題[2]，以及人們越來越追求綠色環保消費，開發安全、高效的天然抗氧化劑成為食品工業的一項重大課題。

海藻是人類在食品、工業和藥用方面的重要資源[3]。近年來，海藻中的次生代謝物質，如萜類、甾醇類、大環內酯類和酚類等已成為研究的熱點，特別是多酚類物質因其所具有的抗氧化特性而備受矚目[4-6]。目前，海帶抗氧化活性物質的研究主要集中于海帶多糖[7-11]，而海帶多酚抗氧化活性的研究相對較少。因此，本文以海帶科植物日本海帶Laminaria japonica為材料，詳細研究了海帶的提取物和萃取分段組分的體外抗氧化活性與多酚含量，并對活性測定方法的有效性進行了評價，為海帶多酚的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮海帶采自浙江舟山，取回后立即放入冰箱冷凍保藏。二苯代苦味酰基自由基（DPPH）、Folin-Ciocalteu試劑為Sigma試劑；鄰二氮菲、鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）、沒食子酸（GA）、硫酸亞鐵、30%過氧化氫（H2O2）溶液、鐵氰化鉀、鄰苯三酚等均為國產分析純試劑。柱層析硅膠（200～300目）和GF254薄層層析硅膠板為青島海洋化工廠生產；所用水均為二次雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化成分的提取[4]

稱取新鮮海帶200 g，室溫下用1:1的氯仿:甲醇超聲提取，過濾，濾渣同上重復提取2次，合并濾液，減壓旋轉蒸發溶劑得粗提物（MC），稱重并計算產率。所得粗提物分散于水中，按1:1的比例依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次，合并萃取液，置于圓底燒瓶中，旋轉蒸發去除溶劑，分別得到石油醚萃取物（PE）、乙酸乙酯萃取物（EA）、正丁醇萃取物（BuOH）和水殘留物（Aqueous），稱重并計算產率。

1.2.2 總酚含量的測定（Folin-Ciocalteu方法）[12]

取1 mL的提取物溶液用1.5 mL雙蒸水稀釋，加入0.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，混勻1 min后，加入1 mL 20%Na2CO3溶液，混勻后于37℃水浴中恒溫30 min，750 nm波長處測定吸光度。利用沒食子酸（GA）做標準曲線計算相應的總酚含量（mg GA/g樣品提取物干重）。

1.2.3 海帶提取物抗氧化活性測定

1.2.3.1 清除 DPPH 自由基的能力測定（DPPH 法）[13]

取海帶提取液2 mL及1×10-4mol/L DPPH溶液2 mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純溶劑作參比，于517 nm波長下測定吸光度。根據下列公式計算每種提取液對DPPH自由基的清除率：

清除率=[1-(AS-ASB)/AC]×100%

其中：AS為加提取液后DPPH溶液的吸光度；ASB為提取液的吸光度；AC為未加提取液時DPPH溶液的吸光度。測定抗氧化劑BHT和GA對DPPH自由基的清除率作為對比。

1.2.3.2 清除羥自由基的能力測定（鄰二氮菲-Fe2+氧化法）[14]

取濃度為0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中，依次加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.40）、1 mL雙蒸水，充分混勻后，加入1 mL濃度為0.75 mmol/L的FeSO4溶液，混勻，加入1 mL質量分數為0.12%的H2O2，37℃水浴90 min，于536 nm處測其吸光度為Ap；用1 mL雙蒸水代替1 mL H2O2為Ab；用樣品溶液代替1 mL的雙蒸水為As。

樣品對羥自由基清除率=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100%

1.2.3.3 還原能力的測定（鐵氰化鉀還原法）[15]

取2 mL樣品溶液于試管中，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）2 mL、1% 鐵氰化鉀2 mL，充分混勻后在50℃保溫20 min，加入2 mL 10%的TCA充分混勻，取出2 mL混合物于試管中，加入2 mL雙蒸水和0.4 mL 0.1%FeCl3于試管中反應10 min，700 nm處測定吸光值，吸光值高表明還原力強。

1.2.3.4 超氧陰離子自由基體系（鄰苯三酚自氧化法）[16]

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液 4.5 mL，置于25℃水浴中預熱 20 min，分別加入 1 mL 試樣和0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入8 mol/L HCl 1.0 mL終止反應，以Tris-HCl緩沖液作參比，在299 nm處測定吸光度，計算清除率。空白對照組以1 mL試樣溶劑代替樣品，每個處理均做3個重復。清除率的計算公式：

超氧陰離子自由基清除率（%）=1（[A1-A2）/A1]×100%

其中A1為空白的平均吸光度，A2為試樣的平均吸光度。

2 結果與分析

2.1 海帶各提取物的提取率

提取率是工業開發利用的一個重要參數，海帶各提取物的產率見表1。結果表明由粗提物溶液經液-液分配所得到的4個萃取相的提取率大小順序為：Aqueous＞BuOH＞PE＞EA。

表1 海帶氯仿-甲醇提取物的提取率（%海帶干重）與萃取部分的提取率（%氯仿-甲醇提取物）Tab.1 Yield of total extract(as%w/w of seaweed on dry weight basis)and fractions(as%of total methanol/chloroform(1:1)extract)of L.japonica

2.2 海帶各提取物的抗氧化活性

2.2.1 清除 DPPH 自由基的能力

DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其結構中含有3個苯環，1個氮原子上有1個孤對電子，呈紫色，在517 nm有強吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數是成化學劑量關系的，因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價實驗樣品的抗氧化能力。不同濃度的海帶各提取物和抗氧化劑BHT和GA溶液的清除DPPH自由基的能力大小見表2。

表2結果表明MC對DPPH自由基有一定的清除作用，且其清除能力與濃度成量效關系。4種萃取物中，除了PE外，其它均具有良好的清除作用，其中EA最高，明顯高于MC和抗氧化劑BHT的清除作用，且其清除能力也與濃度成量效關系。

表2 海帶提取物清除DPPH自由基的能力Tab.2 DPPH radical scavenging activity(%)of total extract and fractions from L.japonica

2.2.2 清除羥自由基的能力

Fenton反應生成羥自由基，促使鄰二氮菲-Fe2+被氧化為鄰二氮菲-Fe3+，造成其水溶液在波長510 nm處最大吸收消失，來測算其清除率。表3所列數據表明MC對羥自由基有較強的清除作用，其清除能力與濃度成量效關系。4種萃取物中，EA和Aqueous在所有測定濃度下均高于GA且其清除能力與濃度成量效關系，且EA萃取物在所有測定濃度下均高于BHT的清除能力。

2.2.3 還原能力

表3 海帶提取物清除羥自由基的能力Tab.3 Hydroxyl radical-scavenging activities(%)of total extract and fractions from L.japonica

還原能力測量法的原理是鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]與樣品反應，將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]，K4Fe(CN)6再與 Fe3＋作用生成普魯士藍，在700 nm波長測定吸光值，吸光值愈高表示還原能力愈強。從表4可以看出MC具有較強的還原能力且與濃度成量效關系。4個萃取物中，除了PE外，其它均具有良好的還原能力，而EA明顯高于MC及其它萃取相，比抗氧化劑BHT略強，但是還原能力明顯低于GA。

表4 海帶提取物的還原能力Tab.4 Reducing power(%)of total extract and fractions from L.japonica

2.2.4 超氧陰離子自由基體系

鄰苯三酚在堿性條件下發生自氧化反應，產生穩定濃度的超氧陰離子自由基O2-與中間物，中間物又與超氧陰離子自由基O2-反應，得到一種帶有顏色的中間產物，此物對紫外線有一定的吸收能力，引起某一波長處吸光值的線性積累，來反應抗氧化劑清除能力的大小。表5表明MC對O2-有較強的清除作用，其清除能力與濃度成量效關系。4種萃取物中，除了PE外，其它均具有良好的清除作用，其中EA明顯高于MC及其它萃取相，且高于抗氧化劑BHT和GA清除O2-的能力。而Aqueous組分清除O2-的能力也高于抗氧化劑BHT。

表5 海帶提取物的體外清除O2-的作用Tab.5 The scavenging effect(%)on O2-of(%)of total extract and fractions from L.japonica

2.3 海帶提取物的總酚含量與抗氧化活性的分析

表6表明粗提物和4種萃取物均含有一定量的酚類成分，其中 EA 總酚含量最高（36.5 mg/g），而 PE 含量最低（11.3 mg/g），該結果與海帶提取物與萃取分段部位的抗氧化作用相一致，表明酚類成分是提取物中抗氧化成分的重要組成部分。

表6 海帶提取物和萃取分段部位多酚含量（mg GA/g海帶提取物干重）Tab.6 Phlorotannin content of total extract and fractions from L.japonica

2.4 海帶提取物體外抗氧化活性方法的相關性分析

4種方法測定的海帶提取物的抗氧化活性的相關性分析如表7所示，結果表明4種方法測定的海帶提取物用量與抗氧化活性之間均具有較好的相關性。其中，提取物清除DPPH自由基能力的相關性最高（R=0.987），其次是清除O2-能力的相關性（R=0.982），而總提取物與還原能力的相關性最差（R=0.946），因此 DPPH 法是測定海帶抗氧化活性量效關系最合適的方法。

表7 海帶提取物體外抗氧化活性方法的相關性分析Tab.7 Correlation between phlorotannin contents and antioxidative activities of extractions from L.japonica

3 結論

（1）在海帶的氯仿-甲醇粗提物（MC）、石油醚萃取物（PE）、乙酸乙酯萃取物（EA）、正丁醇萃取物（BuOH）和水殘留物（Aqueous）中，EA有最強的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力和最強的還原能力，且其清除能力與濃度成量效關系。

（2）總酚含量與海帶各提取物的抗氧化活性之間具有一定的相關性，因此，多酚類物質可能是海帶各提取物的主要抗氧化成分之一。

（3）4種方法測定的海帶各提取物的抗氧化活性的靈敏度分析表明4種方法測定的海帶各提取物用量與抗氧化活性之間均具有很好的相關性，且DPPH法是測定海帶抗氧化活性的最有效的方法。

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