帶魚下腳料水解螯合物制備及其生物特性研究

陳國章，謝 超

(1.浙江興業集團有限公司，浙江舟山 316100;2.浙江海洋學院食品與藥學學院、醫學院，浙江舟山 316004)

帶魚加工過程中會產生許多下腳料，其重量約占原料魚的40%～50%。下腳料中含有豐富的營養成分，有些組分甚至還有一定的功能特性，因而是一類重要的生物資源。長期以來，為了更有效地利用下腳料資源，研究人員進行了廣泛而深入的研究。早在1940年，人們就開始研究酶降解魚肉蛋白[1]。KRISTINSSON和RASCO[2]指出魚蛋白酶解產物具有很多特性，并闡明了很多海洋生物酶解蛋白的生物及其功能特性。KRISTINSSON和RASCO[3]利用由4種商業酶研究了大西洋鮭魚的酶解進程。LIASET等[4]以鱈魚碎肉為原料，利用混合酶研究了魚骨的酶解過程。JRON等[5]利用一系列超濾膜從酶解鱈魚蛋白中分離出多種物質，并研究了具有轉化酶抑制活性的血管緊縮素Ⅰ和其他抗氧化活性物質。鄧尚貴等[6]通過復合酶手段制備得到HOP后，研究了對由環磷酰胺誘導的貧血的治療功效。因此，為了提高帶魚下腳料利用程度，以帶魚下腳料為原料，經復合酶解途徑研究亞鐵螯合物的制備及其結構特點。這些螯合產物經無水乙醇分級沉淀后可得到不同成分，并對這些組分的功能特性進行了研究，將為帶魚的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 酶

木瓜蛋白酶（2×106IU/g）和風味酶(4×105IU/g)購于廣西南寧龐博生物有限公司。最佳水解條件：pH 6.5，45℃，木瓜蛋白酶：風味酶=3:1，反應終止溫度為90℃，反應時間為20 min。

1.2 原料

帶魚下腳料：由浙江興業集團有限公司提供。原料隨機分為2組（A，B）。A組原料經清洗、切碎后室溫均質（3 000 r/min，30 s），貯藏于-18℃條件下備用。本組原料為未脫脂組（FM，含有4.20%的脂肪）。B組原料經清洗、切碎后，在室溫條件下均質（3 000 r/min，30 s）后，用含 0.1%NaHCO3和 0.1%NaCl的溶液脫脂，再用去離子水洗滌至中性。處理后的B組原料貯藏于-18℃備用。B組原料為脫脂組（DM，含有0.60%的脂肪）。

1.3 水解產物的制備

取適量的A、B 2組原料，加入2倍體積的去離子水，調節pH為6.5。水解產物的制備參照鄧尚貴等的復合酶法[7]，復合酶活性比為1:1。水解結束后于90℃保持20 min以終止酶水解，冷卻后過100目篩去除水解產物中的魚骨，然后離心15 min（4,390×g）去除魚油及未水解的魚肉。超濾膜過濾去除分子量低于6 kDa的產物。收集水解產物于4℃條件下儲存備用。

1.4 螯合修飾及組分分離

向一定的水解產物中添加1 mol/L FeCl2(1 mL)，并設置不同溫度和時間。沉淀A（螯合組分CA），螯合后離心15 min（4,390×g）獲得。向離心后的濾出液加入無水酒精，使其濃度達到50%，靜置15 min，離心15 min（4,390×g）獲得沉淀B（螯合組分CB）。向濾出液中繼續添加酒精使得其濃度達到80%，室溫下靜置15 min，產生懸浮物，分離此懸浮物即得到螯合組分CC；而螯合組分CD則沉積于容器底部，可去除溶液后直接獲得。CA,CB,CC和CD于真空條件下（0.1 MPa）50℃干燥3 h后，置于硅膠干燥器保存。

1.5 分析方法

1.5.1 水解度的測定

DH=(h/ht)×100%=[(B-C)/(A-C)]×100%

式中，ht為蛋白質中的總肽鍵數；h為已水解的肽鍵數；A為原料中總氨基氮數；B為水解液的氨基氮數；C為原料游離的氨基氮數。其中，B、C由下列滴定法測得[8]：

取10 mL水解液置于100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度。取20 mL稀釋的溶液轉移到200 mL燒杯中，加入60 mL去離子水，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH為8.2。然后加入10 mL中性甲醛，用0.05 mol/L NaOH滴定pH為9.2，所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積記為V1(mL)，空白試驗采用20 mL去離子水作為樣品，加入甲醛后滴定至終點（pH 9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積記為V2(mL)。計算公式為：

B=[(V1-V2)×M×0.014/(m×20/100)]×100%

V1為樣品加入甲醛后滴定至終點（pH 9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積；V2為空白試驗加入甲醛后滴定至終點（pH 9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積；M為氫氧化鈉標準溶液濃度（mol/L）；0.014為氮的毫摩爾質量（g/mmol）；M為測定用樣品溶液相當于樣品的質量(g)。

C也由上述方法測定完成，用10 mL非酶解樣品替代。

1.5.2 螯合率的測定

1.5.2.1 游離鐵含量的測定

精確稱取0.497 g硫酸亞鐵溶于100 mL水中，加入5 mL濃硫酸微熱，溶解后即滴加2%高錳酸鉀溶液，至最后1滴紅色不褪色為止。用水定容至100 mL，搖勻，得標準貯備液。此液每mL含100 μg Fe3+。取鐵標準貯備液10 mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，得標準工作液。此液每mL含Fe3+10 μg。精確吸取上述鐵標準液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于 50 mL 容量瓶中，加入 1 mol/L 鹽酸溶液 1 mL、10%鹽酸羥銨1 mL、0.12%鄰二氮菲1 mL，然后加入10%乙酸鈉溶液5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的空白液作對比，在510 nm波長處，用1 cm比色皿測光密度，繪制標準曲線。精確吸取濾液N mL(視含鐵量而定)于50 mL容量瓶中，然后按標準曲線繪制操作，測定光密度，在標準曲線上查得相應的鐵含量（μg）。

1.5.2.2 總鐵含量的測定。

準確稱取0.350 8 g硫酸亞鐵銨，溶于25 mL 1∶1(體積比)硫酸溶液中，移入500 mL容量瓶，加水稀釋至刻度。此溶液含鐵0.1 mg/mL。準確移取標準貯備液10.00 mL置于100 mL容量瓶中，加水至標線搖勻。此溶液含鐵 0.01 mg/mL。精密量取 0，1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的鐵標準液分別置于 510 mL 容量瓶中，加入pH 4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液和pH 3.0的0.1%鄰菲羅啉溶液，加入去離子水定容至刻度。在510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。精確吸取濾液N mL(視含鐵量而定)于50 mL容量瓶中，然后按標準曲線繪制操作，測定光密度，在標準曲線上查得相應的鐵含量（μg）。

1.5.2.3 螯合率的計算

CR=[(A-B)/A)]×100%

A(mg/g)，樣品中總 Fe2+含量，B(mg/g)，樣品中游離 Fe2+含量。

1.5.3 螯合組分紅外光譜檢測

取固體樣品2 mg放入瑪瑙研缽中，放入干燥的光譜純KBr 200 mg，混合研磨均勻(在紅外燈下進行)，使其粒度在 2.5 μm 以下，壓力約為 60 MPa，維持 3～5 min。CS，CA，CB，CC 和 CD 的結構由 IR-435 FTS-17SC 紅外光譜儀（Bio-Red Co.Ltd.,USA）于 500～4 000 cm-1條件下測定。

1.5.4 抗氧化活性

抗氧化活性由硫代巴比妥酸法(TBA)測定。亞油酸的氧化測定根據OSAWA和NAMIKI[10]的方法并經少許改進：將0.2 mL亞油酸的樣品加入30 mL試管中，然后加入10 mL 99.5%乙醇和10 mL 50 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。取樣品（50 μg）加入到此混合溶液中，然后用蒸餾水定容至25 mL。將其放入到培養箱中在40℃培養7 d。TBA溶液根據OHKAWA等[9]的方法配制。該溶液含有0.8 mL水分、0.2 mL 8.1%SDS 和 1.5 mL 20%的醋酸，然后用 10 mol/L 的 NaOH 和 1.5 mL 0.8%TBA 調 pH 至 3.5。將 50 μL 的氧化性的亞油酸溶液加入到混合液中，并在5℃培養1 h，然后在100℃，加熱1 h。生成的紅色素采用波長535 nm測定其吸光度。結果表達為對亞油酸的氧化抑制率，采用α-生育酚作對照。抑制率的計算公式：

ROIR=[(A-B)/(A-C)]×100%

A為加50 μL去離子水，0.2 mL亞油酸的吸光值；B 為加50 μg樣品，0.2 mL亞油酸的吸光值；C為加50 μL α-生育酚,0.2 mL 亞油酸的吸光值。

1.5.5 抗菌活性

抗菌能力測定方法：牛津杯雙層平板法[11]。在無菌平皿中倒入10 mL加熱融化的2%瓊脂,待其充分冷卻凝固后，放入已滅菌的牛津杯數個，并按一定次序排放整齊。將分裝于大試管中的15 mL固體檢測培養基融化后冷卻至50℃左右，加入108個/mL指示菌液1 mL，迅速混合均勻，倒入平皿。冷卻后，用無菌鑷子取出牛津杯，作為螯合組分活性檢測平板。用0.1 mL吸管吸取100～200 μL待測樣品，以無菌操作加入到檢測平板圓孔內，37℃培養15 h，觀察并測定抑菌圈直徑(mm)。

2 結果與討論

2.1 原料脂肪含量對水解的影響

由圖1和圖2得出，FM的水解曲線可以分為兩部分，第一部分為快速階段(1～9 h)，大量肽鍵遭到破壞；第二階段反應速度明顯減慢（9～20 h），僅有少量肽鍵遭到破壞。FM的水解曲線從第3 h開始就明顯高于DM的曲線。但由于脂肪得到去除，DM的水解曲線中水解度和水解時間呈現一個典型的線性關系。這是因為DM中一些可溶性蛋白和脂肪被去除的緣故。

圖1 水解時間與DH關系曲線(未脫脂)Fig.1 The relation of hydrolyzed time on DH(fatty)

圖2 水解時間與DH關系曲線(脫脂)Fig.2 The relation of hydrolyzed time on DH(defatted)

2.2 螯合條件的選擇

2.2.1 螯合所需要的 DH 的確定

由圖3可知，FM和DM的水解度低于5%時有最高的螯合率。結果顯示最佳水解度為5%，在此條件下水解產物可以為Fe2+提供足夠的反應底物。

2.2.2 螯合 pH 的確定

如圖4所示，FM和DM的螯合率迅速增加，同時pH從4.0增加到7.0，pH達到7.0后迅速降低。螯合率增加的原因是水解產物氨基和羧基的螯合能力隨著pH從4.0增加到7.0而增強，而當pH達到7.0后螯合率降低是由于Fe2+與OH-更容易結合形成Fe(OH)2。因此螯合最佳pH為7.0。

圖3 不同原料種不同DH和CR的關系Fig.3 Effect of DH on chelating Fe2+

圖4 pH對亞鐵離子螯合率的影響（DH＝5%）Fig.4 Effect of pH on chelating Fe2+（DH＝5%）

2.2.3 螯合溫度與螯合時間的確定

由圖5和圖6可知，隨著溫度由10℃增加到50℃，螯合時間由10 min增加到90 min，FM和DM中Fe2+的螯合率變化很小。這些結果表明溫度和時間對螯合過程沒有顯著影響。所以建議10℃和15 min為螯合所需要的溫度和時間條件。

圖5 溫度對亞鐵離子螯合率的影響Fig.5 Effect of temperature on chelating Fe2+

圖6 時間對亞鐵離子螯合率的影響Fig.6 Effect of time on chelating Fe2+

2.3 螯合物的結構分析

圖7為蛋白質水解物樣品（CS）、CA，CB，CC和CD的紅外光譜圖。同樣品相比，CA，CB，CC和CD的NH4+的吸收光譜帶（3 130～3 030 cm-1）消失，而 PtNH2的吸收光譜帶（約為1 100 cm-1）得到明顯顯現，提示Fe2+與氨基已緊密結合。CA,CB,CC和CD有2個強烈的羧基吸收峰：羧基離子反對稱振動(γascoo-)于1 650 cm-1附近，羧基離子的對稱振動(γscoo-)于1 400 cm-1附近，且CA,CB,CC和 CD 的△υ(γascoo--γscoo-)分別為 235，250，250 和 250 cm-1，提示Fe2+與羧基是以單齒共價鍵的方式結合。CA，CB，CC和CD具有不同的溶解性可能是由于它們的鐵含量不同因而溶解性差異明顯。

圖7 CS、CA、CB、CC、CD 螯合樣品的紅外光譜分析Fig.7 IR spectra of CS，CA，CB，CC，CD peptides chelating Fe2+

2.4 螯合組分的抗氧化性

蛋白質、水解產物或者酶解物亞鐵螯合組分具有其它一些功能性性質。在本文中，筆者研究了帶魚下腳料水解物4種酶解物亞鐵螯合組分(CA，CB，CC和CD)的抗氧化活性，并同初始樣品和a-生育酚進行了比較，如圖8所示。CB的抗氧化活性最高，其抗氧化活性約為初始樣品的1.3倍，為a-生育酚抗氧化活性的92%。CA和CB疏水性更強，原因是它們富含組氨酸，且它們的螯合環增強了組氨酸咪唑環的抗氧化能力。因此CA和CB可以用作天然抗氧化劑。同CA和CB相比，CC和CD具有較好的親水性，在水環境中可溶。這些提示CC和CD可能主要由親水氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、氨基乙酸、丙氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等組成，僅含有少量組氨酸[26]。所以CC和CD可以作為親水性的天然抗氧化劑。

圖8 螯合組分的抗氧化活性Fig.8 Antioxidative activities of peptides and peptides chelating Fe2+

2.5 螯合組分的抗菌活性

酶解物亞鐵螯合組分和初試樣品的抗菌活性見表1。CA對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽胞桿菌無任何抗菌活性。而CB對大腸桿菌具有較弱的抗菌活性，CC對上述4種細菌也具有微弱抗菌活性。在所有4種螯合組分中，CD對4種細菌均有抗菌活性，抗菌活性最高。試驗結果顯示酶解物亞鐵螯合組分具有一定的抗菌活性，這種活性取決于螯合組分的親水性。所以在食品工業中，CD可以用作親水性的天然抗菌劑。

表1 酶解物亞鐵螯合組分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽胞桿菌的抑菌圈直徑Tab.1 The diameter of antibacterial against Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Salmbnella typhi,Bacillus subtilis by peptides chelating Fe2+mm

3 結論

（1）酶解后通過分析發現水解時間和水解度的關系可以表達為DH=5.388 4 lnX+2.636 2(R2=0.992 3)（未脫脂），DH=0.815 7 X+1.086 4(R2=0.993 3（)脫脂）。未脫脂原料的酶解物亞鐵修飾制備條件為：水解度5%，pH 7.0，20℃，螯合時間15 min。通過無水乙醇沉淀可獲得4種以未脫脂魚肉為原料的螯合組分，即CA,CB,CC和CD。

（2）所有4種亞鐵螯合組分都具有顯著的抗氧化活性，可以用作親水或疏水的天然抗氧化劑。在這4種螯合組分中，CB抗氧化活性最高，達到a-生育酚抗氧化活性的92%。同時，在這4種螯合組分中，CD對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的抗菌活性最強，可以作為天然抗菌劑。

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