紅花多糖對人PBMC增殖活性及分泌細胞因子的影響*

石學魁，阮殿清，陶 冀，周明瑤，王亞賢

（1.牡丹江醫學院病原生物學教研室，牡丹江 157011；2.木蘭縣疾病控制中心，哈爾濱 151900；3.黑龍江中醫藥大學微生物與免疫學教研室，哈爾濱 150040）

紅花是一味重要的活血化瘀藥，具有活血、祛瘀、止痛之功效，在歷代醫書及《本草綱目》中均有詳細記載，是傳統復方和現代臨床組方中常用的中藥。紅花成分復雜，作用多樣。據研究，紅花的重要成分之一——紅花多糖（SPS）具有免疫調節功能，如增加溶血空斑數量，并能顯著對抗潑尼松抑制溶血空斑的作用[1]；紅花多糖也具有抗腫瘤作用[2]。本研究通過檢測人外周血單個核細胞（PBMC）的增殖作用及PBMC誘生細胞因子水平，探討SPS對機體免疫功能的影響，以期為該藥應用于抗腫瘤提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 細胞株 小鼠T細胞（CTLL-2，協和醫科大學免疫室惠贈）、人羊膜上皮細胞（WISH，衛生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈）、小鼠成纖維細胞（L929，空軍總院劉麗博士惠贈）。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基（GIBCO－BRL公司）；胎牛血清（FCS，GIBCO－BRL公司）；Ficoll－Urografin淋巴細胞分離液（上海試劑二廠）；植物凝集素 P（PHA－P，Serva產品）；水皰口炎病毒（VSV，衛生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈）；重組白細胞介素－2（rIL－2，軍事醫學科學院中化技術研究所張明偉教授惠贈）；重組腫瘤壞死因子α（rTNF－α）和基因重組干擾素γ（rIFN－γ，邦定生物醫學公司）；氚標記胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）：比放射活性100 mci/mL（中科院原子能所提供）。

1.3 儀器和設備 CO2培養箱（池本理化株式會社，日本）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；酶標微量板測定儀（BIO－T EK INSTRMENTS INC.，美國）。

1.4 紅花多糖的制備 紅花1000g，充分浸漬，90℃提取4 h，邊提邊攪拌，過濾，殘渣重復提取1次，合并兩次提取液濃縮至一定體積，加乙醇終濃度至85%。沉淀物加適量水溶解，置分液漏斗中，加氯仿充分振蕩，放置片刻，除去氯仿層，如此反復操作6次，以除去蛋白質。水層加95%乙醇沉淀，沉淀物先后用無水乙醇、乙醚洗滌3次，干燥后即得SPS。根據預實驗結果，實驗前配制成不同濃度的多糖水溶液，無菌過濾后冰箱保存。

2 實驗方法

2.1 PBMC的分離 取健康人外周抗凝血5 mL，用淋巴細胞分離液，按常規方法分離PBMC。將分離出的細胞用5 mL RPMI 1640培養液洗滌3遍，制成細胞懸液（1×109個/L）。

2.2 PBMC增殖活性檢測 于96孔圓底培養板中每孔加入1×105個人PBMC，分為正常對照組（不加紅花多糖或PHA），植物血球凝集素（PHA）刺激組（PHA終濃度為1g/L），PHA加多糖組（PHA終濃度為1 g/L，紅花多糖濃度為 1.25 g/L），多糖組 1（5 g/L），多糖組2（2.5g/L)，多糖組 3（1.25 g/L），多糖組 4（0.625 g/L），多糖組5（0.312 g/L）。每孔液量為200 μL，作平行3孔。培養 72 h，每孔加3H-TdR 10 μL ，孵育 6 h。用液閃儀測定3H-TdR摻入量，結果以每分鐘脈沖數（cpm）表示。

2.3 細胞因子生物活性檢測 于24孔板中每孔加入1×106個PBMC，分組同2.2。每孔總液量為1 mL，每5孔為1個實驗組。刺激48h，每孔取上清500μL，分裝5份檢測細胞因子。

2.3.1 白介素-2（IL-2）生物活性檢測 取CTLL-2細胞，洗滌3次，以完全培養基調細胞濃度至2×109個/L，按每孔75 μL加入96孔平底培養板中。將IL-2標準品倍比稀釋8個梯度，最大濃度為4×105U/L，每孔25μL，設平行3孔。另取培養上清25μL加入孔中，每份樣品設復孔。對照孔加完全培養基25 μL。5%二氧化碳（CO2）孵箱中孵育 20～22 h，待對照孔細胞死亡大于90%后，每孔加入噻唑藍（MTT）15 μL，繼續培養4 h，每孔加溶解液 100 μL，置孵箱中孵育8 h后，酶標儀上測其光密度值（OD值），測定波長570 nm，參考波長630 nm。

2.3.2 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）生物活性檢測培養的L929細胞，用0.25%的胰酶消化，收集細胞，洗滌2次，用完全培養基調細胞濃度為3×108個/L。按每孔90 μL細胞懸液加入96孔平底培養板中，孵箱中孵育18h細胞長成單層后，加放線菌素D 10 μL（終濃度800 μg/L）。將TNF-α標準品5倍稀釋8個梯度，最大濃度為2×108U/L，每孔加標準品或待測上清樣品10 μL。酶標儀檢測同IL-2。

2.3.3 干擾素-γ（IFN-γ）生物活性檢測 用0.25%的胰酶消化培養的羊膜（WISH）細胞，洗滌2次調細胞濃度為3×108個/L，96孔平底培養板中每孔加入上述細胞懸液100 μL，5%CO2孵箱中孵育2 h。標準品倍比稀釋8個梯度，最大濃度為5×106U/L，每孔加標準品或待測上清25 μL，培養過夜，以每孔100 TCID50水泡性口腔炎病毒（VSV）攻擊WISH細胞，再孵育24 h，待對照組細胞病變大于75%時結束培養。以下MTT測定同IL-2測定。

2.4 統計學分析 使用SPSS 10.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 SPS對人PBMC增殖活性的影響 經SPS作用后，PBMC增殖活性均比正常對照組高，尤以1.25g/L和0.625 g/L劑量組作用顯著（P<0.05），呈現明顯的促進作用，最適宜促進效應濃度為0.625 g/L。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較，未見明顯差異，表明SPS對PHA所致的PBMC增殖反應無協同或拮抗作用。PHA組與SPS各組比較差異顯著，說明SPS雖然對PBMC的增殖有促進作用，但作用程度遠低于PHA。見表1。

表1 SPS對人PBMC增殖的影響(n=7，±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7，±s)

表1 SPS對人PBMC增殖的影響(n=7，±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7，±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常對照組植物凝集素對照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.2552.51.250.6250.312每分鐘脈沖數(cpm)851± 27240398±8727**32950±6142**1131± 2881373± 3452518± 595*4508±1088*1195± 310

3.2 SPS對PBMC產生細胞因子的影響 SPS對IL-2和IFN-γ的產生有明顯的誘導作用，與正常對照組比較差異顯著（P<0.05），但其作用不及PHA（與正常對照組比較P<0.01）。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較，未見明顯差異，表明SPS對PHA刺激PBMC產生IL-2和IFN-γ無協同或拮抗作用。TNF-α 各組之間無顯著性差異（P＞0.05），即 SPS對TNF-α的分泌無明顯誘導作用。見表2。

表2 不同濃度SPS對PBMC產生細胞因子的影響(n=7，±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7，±s)103U/L

表2 不同濃度SPS對PBMC產生細胞因子的影響(n=7，±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7，±s)103U/L

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常對照組植物凝集素對照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.251.250.6250.312 IL-216.45±3.3462.56±13.89**64.57±14.28**38.78±7.98*44.54±9.23*34.12±6.54*IFN-γ 23.55±4.43157.44±29.69**148.67±27.87**76.45±13.87*98.65±17.45*88.43±16.13*TNF-α 5.66±1.766.12±2.346.67±2.894.30±1.454.98±1.895.54±2.86

4 討論

紅花具有抗腫瘤作用，在于其活血、祛瘀、止痛之功效。腫瘤在中醫學中相當于噎膈、癥積、石瘕、痞癖、腸覃、肚腹結塊等，且歷代醫家也多認為腫瘤與瘀血有密切關系，如王清任《醫林改錯》中指出：“肚腹結塊者，必有形之血。”說腹內腫塊，多由血瘀所致，故活血化瘀法是治療腫瘤的主要法則之一。在多種癌癥的臨床治療中以紅花為主藥單用或適當配伍，常常獲得良好療效，原因在于此。紅花多糖是紅花的主要成分之一，作為免疫調節劑具有抗腫瘤作用。本研究紅花多糖（SPS）對PBMC的增殖及PBMC分泌細胞因子的影響，探討其免疫調節作用，為進一步研究紅花多糖的抗腫瘤機制打下基礎。

PBMC主要包括淋巴細胞和單核細胞，而以T細胞占多數。T細胞承擔著抗微生物、移植物排斥和腫瘤的免疫監視等一系列重要生理功能，是細胞免疫的主要執行者，在體內通過分泌IL-2而發揮一系列重要的免疫效應。IL-2主要由CD4、CD8 T細胞產生，可激活單核/巨噬細胞，并增強其殺瘤活性；促進自然殺傷（NK）細胞的細胞毒活性及產生細胞因子，誘導淋巴細胞因子激活的殺傷細胞（LAK）增生；激活B細胞及產生抗體等。淋巴細胞因子活化殺傷細胞（IFN-γ）能促進CTL成熟及活性；激活NK細胞殺傷活性；激活巨噬細胞并促進其活性。研究發現，許多中藥多糖及中藥提取物就是通過促進淋巴細胞增殖及誘生細胞因子的分泌而發揮免疫調節及抗腫瘤作用[3-5]。有些中藥復方也能促進淋巴細胞增殖及提高細胞因子如IL-2的分泌[6]。實驗中，SPS促進PBMC的增殖，進而增強其活性，有助于提高機體的細胞免疫，發揮抗腫瘤、抗感染等作用。SPS誘導PBMC分泌大量細胞因子，尤其是1.25 g/L和0.625 g/L劑量作用顯著。說明SPS具有明顯促進淋巴細胞活化以及促進內源性IL-2、IFN-γ的產生。其結果表明這些細胞因子是SPS發揮藥效的分子介質和物質基礎，是增強機體對各種有害因素的非特異性抵抗力的藥效機制之一。

另外，SPS對TNF-α的分泌無明顯誘導作用，其原因將進一步研究。

綜上所述，紅花多糖（SPS）可促進人PBMC增殖，提高PBMC分泌IFN-γ、IL-2，具有免疫調節作用。因此，SPS可作為免疫調節劑而用于腫瘤治療。

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