補腎調肝法對治療自身免疫性卵巢早衰小鼠的實驗研究*

蔡品均，金 哲，黃文玲，李 玲，林佳靜

（1.北京中醫藥大學研究生，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

卵巢早衰（POF）通常是指女性40歲之前閉經，伴隨持續的卵泡刺激素水平升高和雌激素水平下降。在人群中發生率為1%～3%，在繼發性閉經者中2%～10%[1]。繼發性閉經是POF的主要臨床表現，POF前月經改變的形式不一，約有50%患者會有月經稀發或不規則子宮出血；50%患者突然出現閉經。POF患者會像絕經婦女那樣出現雌激素低下征候群，如潮熱、出汗、抑郁、失眠、記憶力減退、外陰瘙癢、陰道灼燒、尿頻、排尿困難等癥狀。

實驗參照文獻研究[2]制作免疫性小鼠卵巢早衰模型。隨機分6組。造模成功后第6天開始各藥物組灌胃給藥，分別給與補腎調肝中藥及雌激素（戊酸雌二醇），模型組及空白組灌胃同量的0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC）。連續灌胃4周。檢測生殖內分泌指標及卵巢形態改變，旨在探討補腎調肝法對卵巢早衰的治療作用，為指導臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/C小鼠120只，雌性，7～9周齡。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2002-0003，體質量28～30 g，代謝籠中飼養，23～25 ℃室溫，光照 12 h，食水隨意。觀察1周后，隨機分為6組，每組10只。1.1.2 藥物及試劑

1.1.2.1 中藥配置 烏萸湯組方（山茱萸、烏藥等）飲片一次性從同仁堂購入，按國家相關要求經鑒定后確為為正品，由北京中醫藥大學東直門醫院制劑室按常規方法進行煎煮、濃縮，一次性煎出，按照所需配成高、中、低濃度藥液，濃度分別為0.5、1、2 kg/L（即每毫升含生藥 0.5、1、2 g），2～8 ℃條件下保存備用。

1.1.2.2 西藥配置 戊酸雌二醇按l mg/人/d，根據小鼠與人的體表面積進行換算，用三蒸水溶解藥片，制成溶液，保證每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.1.2.3 試劑 超敏雌二醇放免試劑盒（北京北方生物技術研究所20080720雌二醇化學發光試劑盒）、卵泡刺激素放免試劑盒（北京北方生物技術研究所20070520 FSH放射免疫試劑盒）、促黃體生成激素放免試劑盒（北京北方生物技術研究所20070520FSH放射免疫試劑盒）。弗氏完全佐劑（CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法 制作免疫性小鼠卵巢早衰模型：實驗試劑根據小鼠透明帶3（ZP3）的第330～342個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），合成透明帶多肽，其分析純度＞90%。每鼠按0.1 mL免疫試劑（ZP3＋CFA）注射后雙腳掌處皮下，14 d后以新配制的免疫強化試劑 0.1 mL（ZP3＋IFA）再次注射小鼠雙后腳掌處皮下加強免疫。空白對照組注射三蒸水0.1 mL。

1.2.2 分組及給藥方法 小鼠常規喂養標準顆粒飼料，采用隨機數字表將60只小鼠分為中藥高劑量組；中藥中劑量組；中藥低劑量組；西藥組；模型組；空白組。造模成功后第6天開始各藥物組灌胃給藥，烏萸湯高中低劑量組濃度分別為0.5、1、2 kg/L，每只小鼠每次灌胃量為0.02mL/g。西藥組給予戊酸雌二醇按0.009g/L，每只小鼠每次灌胃量為0.02mL/g。模型組及空白組灌胃同量的0.5%的CMC，連續灌胃4周后摘眼球取血，處死小鼠，取組織待測。

1.3 檢測指標

1.3.1 卵巢形態學變化 肉眼觀察:造模后卵巢體積明顯較空白組縮小，且形態細長，模型組更可見部分卵巢組織與周圍組織粘連。光學顯微鏡觀察:造模后與空白組比較可見發育中的卵泡及成熟的卵泡數目明顯減少，依序為：西藥組-大劑量-中劑量-小劑量-模型組，顆粒細胞排列紊亂，且卵巢間質可見淋巴細胞浸潤，嚴重程度依序為：模型組-小劑量-中劑量大劑量-西藥組，部分透明帶縮小或增厚，形態不規整，甚至斷裂，周圍顆粒細胞排列紊亂無序。卵母細胞形態畸形，縮小或消失，畸形程度由重至輕依序為：模型組-小劑量-中劑量-大劑量-西藥組。見圖1。

1.3.2 血清促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）及雌二醇（E2）的檢測 小鼠摘除眼球后采血，離心，取血清。按試劑盒說明書操作要求，采用放免法測定FSH、LH及E2的含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包，計量資料選用ANOVA方差分析、方差齊性檢驗等方法進行統計學分析并進行多重比較，P＜0.05代表有顯著性差異。

2 結果

補腎疏肝法對免疫性卵巢早衰小鼠的FSH、LH、E2含量的影響見表1。灌胃4周后，通過ANOVA方法分析，模型組的FSH、LH、E2均與各組有顯著性差異（P<0.05）。西藥組E2與中藥高劑量組有顯著性差異（P<0.05）。中藥低劑量組的FSH、E2與西藥組有顯著性差異（P<0.05）；與中藥高劑量組有顯著性差異（P<0.05）。中藥中劑量組的FSH、E2與西藥組有顯著性差異（P<0.05）；與中藥高劑量組有顯著性差異（P<0.05）。中藥高劑量組的E2與西藥組有顯著性差異（P<0.05）。

表1 免疫性卵巢早衰小鼠的FSH、LH、E2含量(±s)Tab.1 Comparison of FSH,LH and E2in the rats with autoimmune premature ovarian failure(±s)

表1 免疫性卵巢早衰小鼠的FSH、LH、E2含量(±s)Tab.1 Comparison of FSH,LH and E2in the rats with autoimmune premature ovarian failure(±s)

注：與模型組比較，▲P<0.05；與西藥組比較，★P<0.05；中藥高劑量組比較，●P<0.05。

組別空白組模型組西藥組中藥低劑量中藥中劑量中藥高劑量n 101010101010 FSH(IU/L)0.392±0.150▲0.914±0.277★●0.420±0.189▲0.501±0.232▲★0.488±0.162▲★0.403±0.203▲LH(IU/L)2.956±0.310▲4.613±0.263★●3.242±0.321▲3.302±0.443▲3.086±0.458▲2.622±0.374▲E2(ng/L)21.055±2.060▲●9.125±1.216★●19.812±1.743▲●10.876±1.907★●11.300±1.081★●14.848±0.068▲★

圖1 補腎調肝法治療后的自身免疫性卵巢早衰小鼠的病理切片Fig.1 The pathological section of rats with autoimmune premature ovarian failure after treatment of invigorating kidney and regulating liver

3 討論

實驗采用CFA+ZP31∶1混合液于小鼠雙后腳掌處及皮下多處注射，建立自身免疫性卵巢早衰小鼠模型。旨在觀察中藥對高、中、低劑量組針對自身免疫性卵巢早衰小鼠的治療作用及其與西藥組、模型組之間的差異性。

從生殖內分泌指標來看：模型組的FSH、LH、E2均與各組有顯著性差異（P<0.05）。提示造模成功。西藥組E2與中藥低、中、高劑量組有顯著性差異（P<0.05）。表示西藥在提升E2水平較中藥高劑量顯著。中藥低劑量組與中劑量組的FSH、E2均與西藥組有顯著性差異（P<0.05），提示中藥低劑量組與中劑量組在降低FSH升高、E2的療效不及西藥；但中藥低劑量、中藥中劑量組在與中藥高劑量組在升高E2血清水平上有顯著性差異（P<0.05），提示中藥高劑量療效優于小劑量及中劑量。中藥高劑量組的FSH、LH血清水平與西藥組無統計學意義（P＞0.05）。

在灌胃4周后，中藥高劑量組的FSH、LH血清水平與西藥組無統計學意義，但E2水平升高幅度不及西藥，兩者有統計學意義（P<0.05）。提示中藥高劑量組與西藥組比較，提升E2水平雖不及西藥起效快，但中藥大劑量組能恢復部分卵巢功能，且因中藥不良反應小，經長期服用效果有可能優于西藥組，仍可說明其意義及可行性。進而可得知補腎調肝法對卵巢早衰小鼠具有一定的治療作用，其通過對神經-內分泌系統的調節，從而促進下丘腦-垂體-卵巢功能的恢復。

如何早期預防POF的發生及恢復卵巢功能，提高生活質量，是國內外生殖內分泌學者亟待解決的問題。目前，激素類藥物是一種治療選擇，但長期應用不良反應較大，且不易為所有POF患者所接受。而中醫藥通過多環節發揮整體調節作用，進而改善患者癥狀，且不良反應較小。因此，中醫藥治療POF將是極有發展前景的領域之一。近年來中醫藥在治療卵巢早衰的臨床研究比較活躍。本實驗旨在探討中醫藥在防治卵巢早衰時的思路和方法，以期給臨床治療提供強有力的依據。

[1] Gonway GS Premature ovarian failure[J].Br Med Bull,2000,3(12):643-646.

[2] 付 莉,趙怡璇.卵巢早衰實驗動物模型的建立[J].生殖醫學雜志,2006,15(3):179-183.