HPLC-ELSD法測定枸骨葉中熊果酸的含量

劉宇文，殷紅妹，鄒耀華

（浙江省杭州市藥品檢驗所中藥室，杭州 310017）

枸骨葉為冬青科Aquifoliaceae冬青屬Ilex L.植物枸骨 Ilex cornuta L indl.Ex.Paxt.的干燥葉，《中國藥典》2005年版一部收載本品具有清熱養陰，平肝，益腎的功效[1]。現代藥理學研究表明，枸骨葉具有抗生育，擴張冠狀動脈，抗菌等作用。大量的植物化學研究揭示了三萜及其苷類是枸骨葉中的主要活性成分。然而對于該植物的質量控制分析卻鮮有報道,僅1995年郭亞健等報道了采用薄層掃描法對不同采收期枸骨葉中熊果酸的含量測定[2]，但因枸骨葉中還含有齊墩果酸，兩者同屬三萜酸，性質與化學結構較為相似，薄層色譜（TLC）法定量時，兩者相互干擾，并且熊果酸在紫外區同屬末端吸收，采用高效液相色譜－紫外（HPLC－UV）法測定效果也不太理想。本實驗首次采用蒸發光散射檢測器（ELSD），用高效液相色譜法對枸骨葉中熊果酸進行測定，并進行了方法學考察，獲得了滿意的結果。本研究選擇在枸骨葉中大量存在的三萜類化合物熊果酸為指標，從而為評價枸骨葉藥材的質量提供新的方法和科學依據。

1 儀器與試劑、試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，AlltechELSD 400型蒸發光散射檢測器。甲醇（色譜純，Tedia公司，美國），水（超純水），醋酸銨（分析純，上海金賽醫藥化工有限公司生產）。熊果酸對照品（110742－200516，中國藥品生物制品檢定所），枸骨葉樣品采自杭州，由本所殷紅妹副主任藥師鑒定。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸標準品10.80 mg,置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻。

2.2 樣品溶液的配制 取60℃干燥的枸骨葉粉末（過3號篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定質量，回流提取0.5h，再稱定，并用溶劑補足，搖勻過濾，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：phenomene×C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇：0.5%醋酸銨溶液（92∶8）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；ELSD 漂移管溫度∶60℃，霧化氣體為空氣：3.56bar；放大系數（Gain）：4，在此色譜條件下，熊果酸峰與干擾峰完全達到基線分離（R＞1.5），理論板數以熊果酸峰計在5000 mm以上。對照品溶液色譜圖見圖1，樣品色譜圖見圖2。

圖1 對照品溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard substance

圖2 樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample

3 結果

3.1 線性關系考察 精密吸取熊果酸標準品溶液3、5、10、15、20、30 μL 進樣，注入液相色譜儀測定。以峰面積積分值的自然對數值為縱坐標、進樣量（μg）的自然對數值為橫坐標，采用雙自然對數法進行線性回歸。結果熊果酸線性回歸方程為Y＝1.4667X＋2.6213（r＝0.9998），線性范圍為 0.648～6.48 μg。

3.2 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，重復進樣，6次，熊果酸峰面積平均值為1582.3[相對平均標準偏差（RSD）＝ 1.5%]。

3.3 穩定性實驗 取同一供試品溶液，精密吸取5 μL，每隔2 h測定1次，熊果酸峰面積平均值為1597.8（RSD＝2.0%），說明供試品溶液在 24 h 之內基本穩定。

3.4 重復性實驗 取同一樣品6份，分別按2.2項下方法操作測定。結果樣品中，熊果酸平均含量為1.29%（RSD ＝1.6%）。

3.5 加樣回收率實驗 取3.4項下已知含量的供試品（1.29%）6份，各精密加入熊果酸對照品一定量，照供試品溶液的制備法進行處理，測定其中熊果酸的含量。結果熊果酸的平均加樣回收率為97.1%（RSD＝1.7%）。結果見表1。

表1 加樣回收實驗Tab.1 The recovery rate of added samples

3.6 樣品含量測定 取不同批次枸骨葉樣品,用本實驗方法測定其中熊果酸的含量。結果見表2。

4 討論

本實驗比較了回流提取與超聲波處理兩種提取方法,結果熱回流提取0.5 h的含量明顯高于超聲提取0.5 h，而回流提取1 h與0.5 h含量相當，所以選擇熱回流提取0.5 h作為供試品處理方法。

表2 不同枸骨葉中熊果酸的含量Tab.2 Determination results of different sample %

ELSD作為一種質量型檢測器，在比較寬的范圍內，峰面積（A）與樣品的質量（mg）成雙對數線性關系。定量分析時，為得到精確的數據，應用標準品做校正曲線對實驗條件進行校正或直接用標準曲線法定量。方法中確定的ELSD參數，是經反復實驗后得出的最佳儀器參數，不同的實驗室操作時需注意做相應的調節。

實驗中所用枸骨葉采集時間不相同，熊果酸含量相差不大，而嫩葉含量稍高，與以前文獻報道枸骨葉中熊果酸的含量測定結果基本一致。

本方法快速簡便，重現性好，可為《中國藥典》中枸骨葉藥材的質量標準提高提供一定的參考。另有文獻記載色譜圖中熊果酸附近的干擾峰為齊墩果酸峰[3]，能否利用同一系統同時檢測枸骨葉中兩種物質的含量，有待于進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民國和國藥典[S].北京：化學工業出版社，2005:174-174.

[2] 郭亞鍵,崔玉萍,周 靜,等.不同采集期枸骨葉中熊果酸含量測定[J].中國中藥雜志,1995,20(10):591-593.

[3] 顧學芳,田 澍,黃 丹.苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的提取及含量測定[J].食品研究與開發,2008,29(5):96-98.