初診2型糖尿病患者外周血內皮祖細胞的研究*

陳樹春 宋光耀 孫 陽 馬慧娟

大血管并發癥是糖尿病的重要并發癥，血管內皮功能失調在其發生、發展中起著關鍵作用。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類可特異性歸巢于損傷區域，并能分化增殖為成熟內皮細胞的一群干/祖細胞，其定居于骨髓,可以動員到外周血,遷移、歸巢到血管新生或損傷部位,并在靶區域增殖、分化為內皮細胞，從而修復受損的血管內皮。有學者認為可應用CD34+KDR+的EPCs計數來獨立地預測心血管事件的發生[1]。本研究旨在探討2型糖尿病（T2DM）患者內皮依賴性血管舒張功能及循環EPCs數量的變化,并進一步了解兩者間關系以及炎癥對其影響，以期為預防和治療T2DM血管并發癥的發生、發展提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2008年3月—6月我院門診或住院初診為T2DM患者35例,均符合1999年WHO T2DM診斷標準，均不伴有糖尿病視網膜病變、神經病變及血管病變。正常對照組20例，均為我院同期健康查體者，無糖尿病家族史，排除空腹血糖受損、糖耐量受損及糖尿病。所有入選者均排除高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。?、腦血管病，無肝、腎功能障礙，所有受試者研究期間未應用任何藥物。

1.2 方法

1.2.1 血管內皮功能的測定 根據Celermajer等[2]的方法采用二維超聲成像掃描法分別測定受試者休息、反應性充血試驗及含服硝酸甘油后的肱動脈內徑，分別為D0、D1、D2。內皮依賴性血管舒張功能（EDV）＝（D1－D0）/D0×100%，非內皮依賴性血管舒張功能（EIV）＝（D2－D0）/D0×100%。以肱動脈內徑擴張≥10%為血管內皮功能正常，＜10%為異常。所用儀器為美國通用公司PHILIPS HDI 5000型彩色超聲診斷儀，探頭頻率7.0 MHz，探查深度4 cm。

1.2.2 各項生化指標的測定 所有受試者取血前24 h禁酒，停用所有藥物，經過夜禁食12 h以上，第2天清晨取坐位，經肘正中靜脈取血。采血4 mL離心測三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PBG）、胰島素（FINS）、糖化血紅蛋白（HbA1c）及超敏C反應蛋白（hsCRP）。然后檢測體質量、體質指數（BMI）及血壓。血脂用生化比色法，血糖測定用葡萄糖氧化酶法，胰島素用放免法，hsCRP的測定采用散射比濁法，用李光偉等[3]的公式計算胰島素敏感指數（IAI）來評估胰島素抵抗（IR）。

1.2.3 外周血EPCs水平的測定 受試者清晨空腹采肘正中靜脈血2 mL，肝素抗凝。加入FITC標記的CD34單克隆抗體（BD公司生產），加入PE標記的KDR（VEGFR－2）單克隆抗體（BD公司生產）對細胞進行標記，經孵育、洗滌后上機分析。采用BD公司的FACS Calibur流式細胞儀以CellQuest軟件進行流式細胞分析。在前向角和側向角散射光雙參數點圖上對淋巴細胞群設窗，共收集細胞10 000個，CD34和KDR雙陽性（CD34＋/KDR＋）細胞數即為EPCs水平。

1.3 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理，對所測定結果進行正態檢驗，空腹胰島素（FINS）和呈偏態分布，取其自然對數轉為正態分布后進行分析。組間均數比較用t檢驗或t′檢驗；率的比較采用χ2檢驗，多因素分析用多元線性回歸。相關分析應用Pearson直線相關分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組臨床指標比較2組年齡、性別差異無統計學意義（P>0.05）；T2DM組BMI、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、TG、TC、FBG、HbA1c、hsCRP及FINS高于對照組（P<0.05），IAI顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。T2DM組的EDV水平及EPCs數量較對照組降低，差異有統計學意義（P<0.01），2組間EIV及基礎內徑比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.2 EDV水平與EPCs的關系T2DM組EDV與EPCs的數量呈正相關（r=0.430，P<0.05）。

表1 2組受試者臨床和生化指標比較 （±s）

表1 2組受試者臨床和生化指標比較 （±s）

*P＜0．05，**P＜0．01，表2同；1 mm Hg=0.133 kPa

對照組T2DM t、t′或 χ2 20 35性別（男/女）11/9 19/16 0.003年齡（歲）45.96±6.69 47.94±7.36 0.99 BMI（kg/m2）23.21±2.32 26.06±3.30 3.405 2**SBP（mm Hg）121.30±8.31 132.49±6.38 5.597 2**組別n DBP（mm Hg）74.37±5.40 81.34±8.15 3.804 8*FINS（mU/L）2.13±0.53 2.81±0.58 4.312 1**-3.79±0.57-4.65±0.64 4.982 1**TG(mmol/L)0.99±0.56 1.89±0.10 7.122 8*對照組T2DM t、t′或 χ2 20 35組別nIAI TC(mmol/L)4.41±1.04 5.21±1.10 2.670 8*FBG(mmol/L)5.19±0.67 8.73±2.35 8.338 5*2 h PBG(mmol/L)6.94±2.36 13.00±4.67 6.382 0*HbA1c(%)5.34±0.23 8.36±1.31 13.285 0*hsCRP(mg/L)7.42±0.13 10.68±0.31 54.403 5*對照組T2DM t、t′或 χ2 20 35組別n

表2 2組肱動脈內皮舒張功能及EPCs數量的比較（±s）

表2 2組肱動脈內皮舒張功能及EPCs數量的比較（±s）

組別對照組T2DM t或t′基礎內徑（%）3.49±0.51 3.56±0.50 0.495 9 EDV（%）10.45±3.21 2.62±0.26 10.888 3*EIV（%）13.76±2.31 15.58±6.81 1.442 5 EPCs 14.20±1.92 10.14±1.03 15.587 8**

2.3 多元回歸分析 以EPCs數量作為因變量，將BMI、SBP、DBP、IAI、TC、TG、hsCRP、HbA1c作為自變量，進行逐步多元線性回歸分析顯示，hsCRP、IAI和HbA1c進入方程，方程式為贊=-0.096+0.216 X1-0.247 X2-2.113 X3（：EPCs數量；X1：lnIAI；X2：HbA1c；X3：hsCRP），復相關系數分別為0.324、0.279及0.310，均P<0.05。

3 討論

糖尿病患者是動脈硬化和心血管疾病發生的高危人群。血管內皮是動脈硬化的“第一道防線”，血管內皮功能失調在動脈粥樣硬化的發生、發展中起著關鍵作用，是心血管疾病的危險因素。內皮功能障礙可影響內皮功能的損傷及修復的動態平衡，EPCs是內皮修復的關鍵因素之一，在維持以上平衡中發揮著重要作用。

筆者前期研究顯示，糖尿病的血管內皮功能失調出現在糖尿病診斷之前，且與IR、脂代謝異常及炎癥因子相關[4]。本研究結果顯示，排除藥物、吸煙等影響，未治療的初診T2DM患者存在血糖升高、肥胖、脂代謝紊亂、IR以及血管內皮功能障礙，說明在初診的糖尿病患者已經存在發生大血管并發癥的危險。

內皮功能障礙是由內皮功能的損害和修復之間的動態平衡失調導致，EPCs可以直接分化成內皮細胞，也可以通過旁分泌血管生成因子，動員骨髓祖細胞和激活成熟內皮細胞[5]，使損傷的內皮得以修復，所以EPCs數量和功能下降會影響血管內皮損傷的修復，進而加重內皮功能損傷。本研究結果顯示，初診的T2DM患者存在EPCs數量下降，且EDV與EPCs的數量呈正相關，與Krankel等[6]的研究一致，進一步說明了EFCs對維持正常血管內皮功能的重要性。

本研究以EPCs數量作為因變量進行逐步多元回歸分析表明，hsCRP、lnIAI和HbA1c進入方程，說明炎癥、IR和長期高血糖是EPCs功能和數量的影響因素。有研究表明，健康者的EPCs在高糖條件下培養,其數量、產生一氧化氮（NO）的能力、遷移能力和成血管能力均下降[7]；高糖狀態下造成的氧化應激可使EPCs的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）通路受阻，從而影響EPCs的分化、成血管能力和凋亡；高糖介導的FoxO轉錄因子磷酸化/乙?；Ш饪赡苁笷oxO蛋白表達增加,上調前凋亡基因表達,介導EPCs凋亡，從而影響EPCs的功能和數量[8]。糖代謝紊亂的程度和時間長短與EPCs的數量及功能密切相關，即糖尿病時間越長、血糖越高，EPCs功能損害越重。糖尿病患者的EPCs功能變化在控制血糖后可以部分修復。胰島素有可能通過胰島素受體底物（IRS）和PI3K/Akt途徑發揮雙相作用，在生理濃度下磷酸化Akt可以導致內皮一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化,增加NO釋放，促進EPCs的功能，而在胰島素抵抗時,高濃度胰島素使IRS/PI32K/Akt通路受阻，損害EPCs的功能[9]。炎癥對EPCs的數量和功能存在一定影響，CRP作為一個典型的炎癥因子，可通過減少EPCs NOS表達而抑制EPCs的分化、存活和功能[10]，還可以使EPCs的活性氧（ROS）產生增加，降低細胞的端粒酶逆轉錄酶（TERT）活性，縮短端粒的長度，同時降低EPCs抗氧化酶的表達，上調了EPCs糖基化終產物受體（RAGE）的表達，促使EPCs的氧化應激而發生衰老和功能紊亂，進一步導致細胞凋亡增加[11-12]。

綜上所述，未治療的初診T2DM患者存在與血糖控制、IR及炎癥相關的血管內皮功能受損和EPCs數量及功能的下降，提示良好的血糖控制、改善胰島素敏感性和炎癥控制有益于干預糖尿病血管并發癥的發生和發展。

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