重組華根霉脂肪酶的酶學性質及其對面團熱機械學和烘焙特性的影響

張 巒，黃立群，喻曉蔚，徐 巖，黃衛寧,*，TILLEY Michael

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.美國農業部農業研究局谷物市場與生產研究中心，美國 堪薩斯州 66502)

隨著烘焙工業的快速發展，消費者對烘焙產品品質的要求日益提升，一些對人體存在危害的化學改良劑如溴酸鉀等，逐漸被市場淘汰。如何使用天然無害、具有替代功能的食品添加劑已經成為烘焙行業關注的焦點[1]。生物酶不僅可以大大改善面包的烘焙品質，同時還具備催化效率高、用量少、操作條件溫和等優點[2]。此外高溫烘焙過程可使絕大多數酶變性失活，因而不會對人體產生毒副作用。

脂肪酶是可用于提高烘焙產品品質的酶之一[3]。脂肪酶[4](EC3.1.1.3，lipase)是一類特殊的酯鍵水解酶，作為生物體內一類重要的代謝酶，其主要作用機理是將甘油三酯水解生成甘油一酯、甘油二酯和甘油[5]，甘油一酯、甘油二酯均為優良的乳化劑。近年來，脂肪酶在烘焙制品中的應用引起了國內外學者的研究興趣[6-8]，然而，傳統方法制備的脂肪酶，因其制備成本較高，未能實現在烘焙制品工業化生產中的大規模應用。

根霉脂肪酶是一類典型的微生物脂肪酶，獨特的催化特性使其在脂肪酶理論研究和實際應用中都占有重要地位。傳統脂肪酶的生產是應用誘變野生菌的方法篩選出的，而本實驗采用的脂肪酶是采用基因重組技術高效、精確的改造微生物酶基因，使酶獲得新的特性[9-10]。江南大學生物工程學院以華根霉(Rhizopus chinensisCCTCCM201021)為出發菌株，提取總DNA，應用PCR技術擴增出前導肽脂肪酶基因(proRCL)，利用基因重組技術構建脂肪酶基因的分泌表達載體，克隆到真核表達載體ppzc9k，轉化畢赤酵母GS115，利用真核表達系統進行表達，產生一種新型重組華根霉脂肪酶(Rhizopus chinensislipase，RCL)[11]。

本實驗所用的新型重組脂肪酶可以通過基因重組技術和生物發酵技術從微生物中大量提取，最大化的降低生產成本，性價比較高。這也為脂肪酶在烘焙制品工業化生產中的大規模應用奠定了基礎。雖然國內外對脂肪酶已經有了一些研究，并且取得了一些進展，但機理至今還未完全闡明。本實驗借助新型研究手段——酶流變分析儀分析研究脂肪酶對面團熱機械學特性的影響，同時為今后進一步深入探索脂肪酶在面團制品中的作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉(福臨門加楓牌特級高筋粉) 中糧(張家港)東海糧油有限公司；活性干酵母(燕山即發干酵母) 河北馬利食品有限公司；精制食鹽、白砂糖(均為食品級) 市售；起酥油(全統酥油) 臺灣強冠企業股份有限公司。

重組脂肪酶(RCL，酶活17640U/g) 江南大學工業生物技術教育部重點實驗室；脂肪酶AY“AMANO”(AY，酶活30000U/g) 阿瑪諾天野酶制劑商貿(上海)有限公司；p-NPP、EDTA、2-丁酮、丙酮、乙醚、甲醇 國藥(上海)集團；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

酶流變分析儀 法國Chopin公司；GZX-9540 MBE數顯鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；攪拌機、醒發箱、烤箱 上海早苗食品有限公司：質構儀 英國Stablele Microsystems公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測定

根霉脂肪酶活測定方法為p-NPP法[12]。將溶解有底物30mg對硝基苯酚棕櫚酸酯的10mL異丙醇和溶解有207mg脫氧膽酸鈉和100mg阿拉伯樹膠粉的90mL 0.05mol/L的磷酸鉀緩沖液混勻備用。在反應體系中加入2.4mL上述底物，加入0.1mL適當稀釋的酶液，一定條件下反應，在410nm波長處用空白作為對照測定吸光度A410nm，根據對硝基苯酚標準曲線，由吸光度查出對硝基苯酚的濃度并計算酶活力。一個酶活力的定義為一定反應條件下每分鐘產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個脂肪酶水解酶活力國際單位。

1.3.2 酶學性質研究

1.3.2.1 pH值對脂肪酶活力和穩定性的影響

pH值對脂肪酶活力的影響[10]：將脂肪酶液分別用不同pH值(pH6.0～10.0)的緩沖液稀釋，按標準方法測脂肪酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

pH值對脂肪酶活力穩定性的影響[10]：將脂肪酶液用不同pH值(pH6.0～10.0)的緩沖液稀釋，25℃保溫1h，按標準方法測殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.2.2 溫度對脂肪酶活力和穩定性的影響

溫度對脂肪酶活力的影響[10-11]：將脂肪酶液分別在不同的溫度(20～60℃)下按標準方法測定脂肪酶活力。

溫度對脂肪酶活力穩定性的影響[10-11]：將脂肪酶液分別在不同的溫度(20～60℃)下保溫1h，迅速冷卻，按標準方法測殘余脂肪酶活力，以未保溫酶液的活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.3 脂肪酶對面團熱機械學特性測定

水分測定參照 AACC44-15A[13]。采用酶流變分析儀[14]測定小麥粉加水混合形成面團過程、面團加熱糊化過程和冷卻過程面團熱機械學特性變化，同時該設備還可用來分析加熱冷卻過程中面筋蛋白網絡結構及淀粉的性質。分別對含0、1000、2000U/kg (以小麥粉質量計)脂肪酶的小麥粉進行測定，攪拌速度80r/min；首先保溫7min，以2.3℃/min的速率升溫至90℃，保持7min，后以4℃/min的速率降溫至50℃，保持5min，總時間為45min。

由酶流變分析儀圖譜可得到以下參數[15-18]：吸水率指使面團產生(1.1±0.07)N·m所需的加水量/%；面團形成時間指在30℃達到最大扭矩所需時間/min；穩定時間指面團所產生的扭矩保持在1.1N·m的時間/min；C1用來表征面粉的實際吸水率；最小扭矩(C2)為在面團形成過程中受到機械或熱力作用時的最小扭矩值；峰值扭矩(C3)為面團在加熱階段產生的最大扭矩；C4為加熱時的最小扭矩；C5為冷卻至50℃的扭矩；蛋白質弱化(C1－C2)為在30℃時的最大扭矩與最小扭矩的差值；C4/C3為蒸煮穩定性；回值(C5－C4)為冷卻到50℃的扭矩與加熱時最小扭矩之差。此外，曲線中扭矩的升降斜率表示為α、β、γ，分別對應3個角的ta n值，α表示的是蛋白質隨溫度穩步上升發生的弱化；β表示淀粉的糊化；γ表示淀粉的破損。以上實驗重復操作兩次。

1.3.4 面包樣品的制備[19]

原料添加量為小麥粉100%、食鹽1%、白砂糖8%、黃油8%、酵母1.5%、水60% (均以小麥粉質量計)，脂肪酶的添加量分別為0、1000、2000U/kg。將上述原料于攪拌機中攪拌10min后，靜置10min，分割成100g/塊，搓圓，靜置20min，裝盤，于38℃、相對濕度85%的條件下醒發90min，烘焙15min(上火170℃、下火210℃)，冷卻后測量比容、質構等。

1.3.5 面包比容測定

菜籽置換法[19]測定面包體積并稱質量。

1.3.6 面包感官評價

參照GB/T 14611—1993《小麥粉面包烘焙品質試驗法》評分標準，對面包鑒定評分。

1.3.7 面包全質構測定[20]

將面包芯切成厚度為20mm的厚薄均勻的薄片，選取中間固定位置進行測定后取平均值。參數設定[14]：探頭型號為P/36型探頭、測試前速率1.0mm/s、測試速率3.0mm/s、測試后速率3.0mm/s、壓縮程度50%、感應力5g、兩次壓縮間隔時間1s。

1.4 數據收集和統計分析

實驗中測定所得的數據統計使用S P S S軟件及Microsoft office Excel 2007進行分析。

2 結果與分析

2.1 重組脂肪酶的酶學性質

2.1.1 最適pH值和pH值穩定性

圖1 pH值對脂肪酶活力的影響Fig.1 Optimum reaction pH for two lipases

酶催化反應速率與pH值有關，在不同pH值條件下進行酶促反應，測定酶液的脂肪酶活力，結果見圖1、2。

由圖1可知，重組脂肪酶催化反應的最適pH值分別為8.5，pH值的增加或降低都會導致脂肪酶活力的顯著下降，說明重組脂肪酶為一種堿性脂肪酶。而脂肪酶AY最適pH值為7，為中性脂肪酶。

圖2 pH值對脂肪酶活力穩定性的影響Fig.2 pH stability of two lipases

經過不同pH值放置1h后測定酶液的脂肪酶活力，與最適pH值的酶活力作為對照計算殘余酶活力。從圖2可以看出重組脂肪酶在pH3～9范圍內穩定性較好，而脂肪酶AY的pH值穩定性相對較差。

2.1.2 最適溫度和熱穩定性

圖3 溫度對脂肪酶活力的影響Fig.3 Optimum reaction temperature for two lipases

圖4 溫度對脂肪酶活力穩定性的影響Fig.4 Thermal stability of two lipases

酶催化反應速率與溫度有關，在不同溫度條件下進行酶促反應，測定酶液的脂肪酶活力，結果見圖3、4。

由圖3可以得出，重組脂肪酶催化反應的最適溫度為40℃。隨著溫度的升高，酶活力也逐漸升高；但是當溫度高于40℃后，酶蛋白逐漸變性，酶蛋白活力顯著下降；AY脂肪酶的溫度范圍相對更寬，最適溫度為45～50℃。

經過不同溫度下保溫1h后測定酶液的脂肪酶活力，與不保溫的酶活力作為對照計算殘余酶活力。從圖4可以看出，重組脂肪酶在高于最適溫度后活力下降顯著，在40℃以下較為穩定；AY脂肪酶的熱穩定性相對更好。

2.2 脂肪酶對面團熱機械學特性的影響

表1 不同脂肪酶添加量對面團熱機械學特性的影響Table1 Effect of separate amounts of two lipases on thermomechanical characteristics of dough

從表1可以看出： 1)C1：向面粉中添加不同量的脂肪酶后，C1值略有增加，說明添加脂肪酶后可使得面粉的吸水率增加。2)面團形成時間：面團形成時間主要與蛋白質的含量呈正相關，添加脂肪酶后，面團形成時間增加，說明脂肪酶具有提高面團筋力的作用，尤其是脂肪酶AY，對面團筋力的改善效果更明顯；3)面團穩定時間：面團穩定時間主要用來表征面團的耐揉性，穩定時間越長，面團的韌性越好，面筋的強度越大，面團的加工特性越佳。由表1可知，脂肪酶AY對面團耐揉性影響不顯著，但是脂肪酶RCL會在一定程度上降低面團的耐揉性；4)C1寬度：主要用來表征面團的彈性，寬度越大，面團的彈性越大。添加脂肪酶后，面團的彈性大大增加，而且脂肪酶RCL對面團的增加效果更明顯；5)回值(C5－C4)：回值描述的是淀粉的凝膠化過程，由于加熱處理，使直鏈淀粉從淀粉顆粒中釋放出來，從而促進了直鏈淀粉重結晶。淀粉分子間特別是直鏈淀粉相互結合，形成了凝膠結構。該過程與淀粉分子的老化和重排相關。隨著脂肪酶含量的增加，回值增加比較明顯，尤其是脂肪酶AY；6)脂肪酶對面團的蛋白質弱化度和蒸煮穩定性基本上沒有什么影響。

2.3 脂肪酶對面包烘焙品質的影響

2.3.1 脂肪酶對面包比容的影響

圖5 脂肪酶添加量對面包比容的影響Fig.5 Effect of two lipases on specific volume of bread

由圖5可知，添加脂肪酶后，面包的比容有較大增長。其中脂肪酶的添加量為1000U/kg時，面包比容增加效果明顯，但是隨著添加量的增加，面包的比容有較大的下降。對不同的脂肪酶來說，在相同酶活力的情況下，RCL比 AY效果更好。當脂肪酶添加量為1000U/kg時，RCL使比容增加約31.16%，AY使比容增加約21.86%。

2.3.2 脂肪酶對面包感官品質的影響

圖6 脂肪酶添加量對面包感官指標的影響Fig.6 Effect of two lipases on sensory evaluation of bread

由圖6可知，添加脂肪酶后，面包的感官品質有較大程度的提升，但是隨著添加量的增加，面包的感官品質略有降低。當酶的添加量達到2000U/kg時，口感、黏彈性和比容都有一定程度的下降。但是通過2種脂肪酶的對比發現，添加RCL比AY更有助于提高面包的感官品質。

2.3.3 脂肪酶對面包內部結構的影響

圖7 脂肪酶對面包內部結構的影響Fig.7 Visible observation of the effect of two lipases on texture of bread

由圖7可知，不添加脂肪酶的面包，面包氣孔大小不均勻，孔壁較厚；添加脂肪酶后，面包的氣孔更加緊密，氣孔大，較均勻，成海綿狀，按壓后恢復速度快，彈性好。此外，添加1000U/kg脂肪酶的面包，相對于2000U/kg來說，氣孔緊密型更好，同時添加RCL比添加AY效果更顯著。

2.3.4 面包的全質構分析

對面包質構的分析不僅可以通過感官評定，還可以通過質構儀進行評價。而且相對來說采用質構儀測定的更為準確和方便。

表2 脂肪酶對面包質構特性的影響Table2 Effect of two lipases on the values of texture parameters of bread

由表2可知，兩種脂肪酶的添加都使面包的硬度降低，但隨著脂肪酶添加量的增加，面包的硬度回升。當脂肪酶添加量為1000U/kg時，含RCL的面包比含AY的面包硬度減少更顯著，面包更松軟；兩種脂肪酶的添加均使面包的彈性增加，且RCL對面包彈性的影響與AY幾近相同；兩種酶對面包黏聚性的影響差別較大，含RCL的面包黏聚性下降，而含AY的面包略有上升；含RCL面包咀嚼性略有降低，而含AY的面包咀嚼性基本不變。兩種酶均可改善面包的質構，RCL的改善效果優于AY。

2.4 面包感官品質和面包各質構參數之間的相關性分析

表3 面包感官品質和各質構參數之間的相關性Table3 Correlation coefficients between texture parameters and sensory score of bread

由表3可知，面包的感官品質和面包的比容成顯著正相關，其主要原因應歸結于面包感官評分中比容評分占到35%的緣故；面包的品質與面包的彈性呈正相關，與硬度呈負相關，面包硬度越小，則彈性越大，品質越好；同時其感官品質與黏聚性和咀嚼性均為負相關。

3 結 論

本研究針對脂肪酶改善面包烘焙品質方面進行了初步研究。結果顯示：RCL的最適反應條件為40℃、pH8.5，其在40℃以下、pH3～9范圍內穩定性較好，RCL凍干粉酶比活力約為17640U/g；兩種脂肪酶均顯著影響面團的熱機械學特性，提高面團的筋力和彈性。兩種脂肪酶對面包的烘焙品質也有明顯的改善作用，特別是重組脂肪酶RCL，不僅能夠增加面包的比容和彈性，同時還能降低面包的硬度、黏聚性和咀嚼性。

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