羅伊氏乳桿菌培養基優化及其生長代謝研究

陳 國，肖雅琴，陳宏文

(華僑大學化工學院，工業生物技術福建省高校重點實驗室，福建 廈門 361021)

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)常棲息于人和動物的腸道系統中，對人和動物無害，具有良好的生物相容性。它代謝甘油產生一種特殊的抑菌物質——羅伊氏素(reuterin)，其主要成分是3-羥基丙醛(3-HPA)的單體、水合物和環化二聚體[1]。

羅伊氏素中的主要成分3-HPA單體是一種潛在的重要化工原料，可作為多種新興化學品如丙烯醛、丙烯酸、1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PD)等的前體，用于制備新型聚合物材料[1]；可和蛋白質中的氨基反應形成交聯，有望取代化學合成的戊二醛和環氧化合物作為新型生物交聯劑[2-3]；可抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌、病原蟲、原生動物等的生長[4-6]，正逐步被開發成新型廣譜抗菌劑，包括用作生物防腐劑[7-8]、生物滅菌劑[9]、口香糖添加劑[10]和抗感染治療劑[11]。瑞典BioGaia 公司已經開發了一系列包含L.reuteri的益生菌制劑，在全世界范圍內銷售，用于改善人和動物的健康水平。我國衛生部也于2003年批準羅伊氏乳桿菌作為保健食品益生菌種。但對其培養基和培養條件的優化簡化少見于文獻。因此，研究L.reuteri的生長及代謝具有重要意義，將為L.reuteri發酵甘油制備3-HPA提供參考。

響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優化工藝條件的有效方法，中心組合設計(CCD)可用于確定實驗因素及其交互作用對指標響應值的影響，精確表述因素和響應值之間的關系[12]。本實驗先進行單因素試驗確定氮源，再用Plackett-Burman設計考察L.reuteriCG001 MRS培養基、pH值及培養溫度，篩選出4個關鍵因素，進一步用CCD設計對關鍵因素進行響應面優化分析，得到最優培養條件，最終在成本降低的情況下獲得更高菌體質量濃度。最優條件下在發酵罐中厭氧培養L.reuteriCG001，測定其基本生長代謝情況。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：羅伊氏乳桿菌(L.reuteriCG001)由工業生物技術福建省高校重點實驗室篩選保藏。

MRS培養基：蛋白胨 10g、牛肉膏 10g、酵母浸膏 5g、葡萄糖 20g、磷酸氫二鉀 2g、醋酸鈉 5g、檸檬酸銨 2g、硫酸鎂 0.2g、硫酸錳 0.05g、吐溫-80 1g，蒸餾水1000mL，pH 6.2～6.6。

1.2 方法

1.2.1 MRS培養基的配制及菌種的培養

配制MRS培養基，充氮氣并加膠塞和鋁蓋，滅菌后按體積分數1%接種，37℃靜置培養。最優條件下以5%接種量于發酵罐中培養時，以恒定流速充氮氣保證其厭氧環境，攪拌轉速200r/min，pH5.5。

1.2.2 菌體質量濃度的測定

建立光密度(OD600nm)與干質量濃度(cell dry weight，CDW)的標準曲線，測OD600nm換算菌體質量濃度。

1.2.3 發酵上清液中葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇質量濃度的測定

采用HPLC法：AminexHPX-87H柱，柱溫60℃，流動相為5mmol/L硫酸，流速0.6mL/min，示差折光檢測器(RID)，手動進樣20μL。

1.3 實驗設計

以菌體質量濃度為響應指標，采用3步進行優化：首先進行單因素試驗確定氮源；其次運用Plackett-Burman設計選出對響應值影響較大的幾個因素；然后再采用響應面法中的CCD進行試驗，通過實驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優實驗條件，并進行驗證實驗。

1.3.1 菌體生長氮源的選擇

原始MRS培養基是富集培養基，其中含蛋白胨、牛肉膏和酵母膏3種氮源，為降低成本并與大豆蛋白胨、玉米漿干粉及酵母粉進行比較，用單因素試驗篩選出滿足菌體生長的單一氮源。試驗中各種氮源的質量濃度保持一致，為10g/L，培養基的其他因素及水平不變。

1.3.2 Plackett-Burman設計對試驗因素的篩選

根據單因素試驗結果，應用Design Expert軟件對MRS培養基及培養條件進行Plackett-Burman設計(表1)。以菌體質量濃度為響應值，對影響菌體生長的10個主要因素進行篩選：即酵母膏、葡萄糖、檸檬酸銨、醋酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳和吐溫-80的質量濃度，初始pH值，培養溫度，外加一個虛擬變量。每個變量分別確定高(+1)和低(－1)兩個水平，共進行12次試驗以確定每個因素的影響水平。

表1 Plackett-Burman設計各因素水平Table1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

Plackett-Burman試驗設計中，應用線性函數進行因素篩選并忽略相互作用。對軟件擬合的線性方程進行方差分析及顯著性分析，評價各因素的效應及重要性。

1.3.3 CCD方法對主要因素水平的篩選

由Box和Wilson開發的CCD可通過最少的實驗來擬合響應面模型，每個因素通常設計5個水平，一般采用二階經驗模型對變量的響應行為進行表征[12]。

應用Design Expert軟件，采用CCD方法，對Plackett-Burman篩選出的4個主要因素(酵母膏質量濃度、葡萄糖質量濃度、硫酸錳質量濃度和培養溫度)進行試驗設計(表2)。同時根據Plackett-Burman設計擬合出的線性方程，若偏回歸系數為正值表明該因素起正效應，取高水平；若系數為負值則表明該因素起負效應，取低水平，固定其他非關鍵因素。

表2 CCD各因素水平Table2 Factors and levels in the central composite design

2 結果與分析

2.1 菌體生長氮源選擇試驗結果

圖1 不同氮源對菌體質量濃度的影響Fig.1 Effect of nitrogen source type on the growth of L.reuteri CG001

由圖1可以看出，不同氮源對菌體質量濃度的影響較大，綜合成本最低和滿足菌體生長需要兩方面考慮，酵母膏作為氮源最合適。

2.2 Plackett-Burman設計試驗結果

應用Design Expert軟件對表3中菌體質量濃度進行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數及其顯著性，結果見表4。

表4 偏回歸系數及影響因素的顯著性分析Table4 Partial regression coefficients and corresponding significance analysis

式中：Y為菌體質量濃度/(g/L)；A、B、C、D、E、F、G、J、L分別表示Plackett-Burman設計中各因素的水平。

由表4可以看出，此模型的F值是24.28，表明該擬合模型很顯著，并且僅僅只有4.02% 的機會是由于噪聲引起的。方差分析模型的Prob＞F值為0.0402小于0.05，表明所得回歸方程顯著，即該模型的整個回歸區域擬合較好；復相關系數R2=0.9909，說明相關性很好；校正決定系數R2Adj=0.9501，表明95.01%試驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋；通常情況下變化系數(C V)越低實驗的可信度和精確度越高，本試驗CV=4.80，表明Plackett-Burman試驗的可信度和精確度很好；精密度(adeq precision)是有效信號與噪聲的比值，

表3 Plackett-Burman試驗設計結果Table3 Plackett-Burman design matrix and experimental results

大于4.0視為合理，本試驗精密度達到14.972。另外，通過偏回歸系數的正負值確定非關鍵因素如下：檸檬酸銨質量濃度1g/L、醋酸鈉質量濃度7g/L、磷酸氫二鉀質量濃度3g/L、硫酸鎂質量濃度0.2g/L、吐溫-80質量濃度1g/L、初始pH6.2。

2.3 CCD試驗結果與響應面分析

表5 CCD試驗結果Table5 Central composite design matrix and experimental results

式中：Y為響應值，即菌體質量濃度/(g/L)；A、B、C分別為酵母膏質量濃度/(g/L)、葡萄糖質量/(g/L)濃度和硫酸錳質量濃度/(g/L)；D為培養溫度/℃。

對二次模型的方差分析見表6。

表6 CCD試驗結果二次模型的方差分析Table6 Variance analysis for the developed regression model

由表6可知，F值為4.12，多元相關系數為R2=0.9058，說明模型對實際情況擬合比較好；Prob＞F值為0.0455，表明該模型擬合效果顯著。

表7 二次模型回歸方程系數顯著性檢驗Table74 Significance test for coefficients of the developed regression model

二次模型中回歸系數的顯著性檢驗(表7)表明：Prob＞F值為0.0334，小于0.05，所以因素A對菌體質量濃度的線性效應顯著；而因素B、C、D不顯著；Prob＞F值為0.0487，小于0.05，所以因素D2對菌體質量濃度的曲面效應顯著，而因素A2、B2和C2不顯著；AB、AC、AD、BC、BD、CD對菌體質量濃度的交互影響都不顯著。

應用Design Expert軟件對多元回歸方程(2)繪制響應曲面圖及其等高線圖。對任何兩因素交互影響L.reuteriCG001的菌體質量濃度進行分析與評價，以確定最佳因素水平，結果見圖2～7。根據響應面法原理，當等高線圖為橢圓或圓時，它的中心是響應值的最大值或最小值，若未出現，則說明各因素交互作用不顯著。

圖2 酵母膏和葡萄糖對菌體質量濃度交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots illustrating the cross-interaction effect between yeast extract and glucose on the growth of L.reuteri CG001

圖2顯示，酵母膏質量濃度和葡萄糖質量濃度對菌體質量濃度的交互影響不顯著。

圖3 酵母膏和硫酸錳對菌體質量濃度交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between yeast extract and manganese sulfate on the growth of L.reuteri CG001

圖3顯示，酵母膏質量濃度和硫酸錳質量濃度對菌體質量濃度的交互影響不顯著。

圖4 酵母膏和培養溫度對菌體質量濃度交互影響的相應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between yeast extract and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

圖4顯示，酵母膏質量濃度和培養溫度對菌體質量濃度的交互影響不顯著。

圖5 葡萄糖和硫酸錳對菌體質量濃度交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between glucose and manganese sulfate on the growth of L.reuteri CG001

圖5顯示，葡萄糖質量濃度和硫酸錳質量濃度對菌體質量濃度的交互影響不顯著。

圖6 葡萄糖和培養溫度對菌體質量濃度交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between glucose and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

圖6顯示，葡萄糖質量濃度和培養溫度對菌體質量濃度的交互影響不顯著。

圖7 硫酸錳和培養溫度對菌體質量濃度交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots illustrating the cross interaction effect between manganese sulfate and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

圖7顯示，硫酸錳質量濃度和培養溫度對菌體質量濃度的交互影響極顯著，因為這是表5中21組實驗以外的情況，存在穩定點并有最大值，對二次方程(2)求一階偏導得出坐標(C，D)=(0.3，0.73)，即硫酸錳質量濃度為0.23g/L，培養溫度為38.6℃。

綜合Plackett-Burman試驗設計結果及響應面分析，取軟件設計中的10組優化條件中最好的一組(取值與上述不同)，確定最優培養條件為：酵母膏質量濃度20g/L、葡萄糖質量濃度20g/L、硫酸錳質量濃度0.23g/L、培養溫度38.6℃，理論計算菌體質量濃度為0.997g/L。

2.4 驗證實驗

按照優化后L.reuteriCG001的培養條件：酵母膏質量濃度20g/L，葡萄糖質量濃度20g/L，檸檬酸銨質量濃度1g/L，醋酸鈉質量濃度7g/L，磷酸氫二鉀質量濃度3g/L，硫酸錳質量濃度0.23g/L，硫酸鎂質量濃度0.2g/L，吐溫-80質量濃度1g/L，初始pH6.2，培養溫度38.6℃，進行驗證實驗，實測菌體質量濃度達到0.984g/L，與預測菌體質量濃度0.997g/L較接近，預測精度達98.69%，且最終菌體質量濃度是優化前的1.102倍。這證明了Plackett-Burman設計和CCD方法聯用的可行性，也證明了響應面法應用于培養基優化的高效性。

2.5 發酵罐厭氧培養L.reuteri的生長代謝曲線與分析

圖8 5L發酵罐中L.reuteri CG001的生長曲線Fig.8 Growth curve of L.reuteri CG001 in a 5 L fermentor

圖8顯示，5L發酵罐厭氧培養L.reuteriCG001 的生長曲線呈S型，4～12h菌體處于對數生長期，之后趨于平衡，即可收獲菌體。

圖9 發酵液中葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇質量濃度隨時間變化曲線Fig.9 Concentration versus time curves of glucose, lactic acid, acetic acid and ethanol during fermentation

從圖9可以看出，發酵上清液中葡萄糖的質量濃度明顯下降至接近零，可知它的消耗速率與菌體的生長速率相對應；乳酸和乙醇是葡萄糖代謝的產物，它們的質量濃度都在上升，而乳酸產量居多；乙酸的質量濃度從始至終變化不大，可能是因為培養基本身含有乙酸鈉，發酵過程 pH值 通過調節一直恒定在5.5左右導致的。菌體二步法轉化甘油制備3-HPA的研究中，第一步就是在最適菌生長的條件下獲得大量菌體，所以本實驗對L.reuteri的培養基進行優化并對其生長代謝作基礎研究，這是二步法的前提。

3 結 論

大量前期的研究中羅伊氏乳桿菌的MRS培養基是富集培養基，組分較多，成本較高，實驗操作復雜。本實驗先用單因素法優化氮源，再結合Plackett-Burman與CCD設計篩選出最優配方，減少了培養基組分，降低了部分成本，使操作簡單化，并增加了菌體產量。

本實驗結果證明：Plackett-Burman設計方法可從影響培養基的多種組分中高效地篩選出關鍵因素；CCD設計和 RSM分析可實現關鍵因素的合理優化，在降低培養基氮源成本的情況下，實測菌體質量濃度達到0.984g/L，接近預測值0.997g/L，且最終菌體質量濃度是優化前的1.102倍。

用最優條件在5L發酵罐中厭氧培養的L.reuteriCG001的生長曲線呈S型，4～12h是菌體的對數生長期，之后趨于平衡，即可收獲菌體。

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