雙孢菇培養基堆制產熱過程中微生物變化對其理化性質的影響

劉 燦，生吉萍，鄒積華，王鴻磊，丁 強，申 琳,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業大學煙臺研究院，山東 煙臺 264067)

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus(Large) Sing]是目前世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌[1]。雙孢菇培養料發酵分為一次發酵和二次發酵，目前國內外都以二次發酵為主，二次發酵的主流是采用發酵倉系統模式進行的[2]。機械化生產雙孢菇時，培養基發酵主要采用現在室外簡易棚中進行前發酵，然后在隧道中進行后發酵，后發酵的隧道采用電腦自動控制生產，控溫、控濕、控氣[3]。通過二次發酵，培養料中存在著復雜的生物降解作用，不同種類的微生物群落交替作用，結合各種化學反應，使得培養料成為有利于蘑菇菌絲生長的選擇性基質[4]。

目前，對于培養料二次發酵過程是一個非人工加熱而自產熱過程，其中微生物交替及代謝起到非常重要的作用。前發酵過程中，一些中溫微生物首先利用原料中簡單的有機質，產生有機酸、CO2和熱量，使料溫上升，嗜熱微生物開始代替中溫微生物，成為優勢群落。在堆制前期料溫升至60℃以上時，細菌能大量繁殖，培養料中易揮發固體和大量簡單的易被降解的糖由細菌分解掉[5]，這時很少分離到真菌[6]。在堆制后期，隨料中營養物質的分解轉化，料溫下降，許多嗜熱或耐熱放線菌及霉菌在此營養和生態環境下開始大量繁殖[7]。后發酵大致可以分為4個階段：平衡溫度、巴氏殺菌、空氣調節和冷卻[8]。一方面通過巴氏殺菌殺死病蟲危害及其蟲卵和一些有害的微生物及孢子，另一方面通過空氣調節促進培養料進一步轉化為利于蘑菇菌絲吸收利用而競爭性雜菌不易利用的選擇性培養料[9]。

針對雙孢菇培養料工廠化制備的二次發酵過程中，微生物自動產熱，其中微生物及培養基理化性質變化的研究目前很少見報道，本實驗監測雙孢菇培養料二次發酵過程中的細菌、霉菌、放線菌的數量變化，包括物理感官特性、含水量、pH值、硝態氮含量這些理化指標，為更全面了解在此過程中微生物對于培養基中底物的降解及產物生成的促進作用并通過微生物調控提高發酵效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢菇培養料，取自山東省九發食用菌股份有限公司的培養料制備車間。培養料配方見表1。

表1 雙孢菇培養料成分Table1 Components of the Agaricus bisporus compost used in this study

1.2 培養基

營養瓊脂(NA)培養基用于細菌的培養；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基用于霉菌的培養；高氏一號培養基用于放線菌的培養。

1.3 樣品編號及取樣時間

表2 雙孢菇培養料樣品編號及取樣時間Table2 Collection time points of Agaricus bisporus compost and corresponding numbers

1.4 雙孢菇培養料的采集

在每次倒料過程中分別每5～7鏟車取樣100g，使得能夠取到培養料堆各部位的樣品。取樣后放入液氮中速凍后于－80℃保存。

1.5 方法

1.5.1 細菌總數測定

參照GB/T 13093—1991《飼料中細菌總數的測定方法》進行測定。無菌稱取10.0g樣品，放入含有90mL無菌水的三角瓶內(瓶內預先加有適量的玻璃珠)，200r/min振蕩30min，制成1:10的混勻稀釋液。吸取10-1稀釋液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀釋液的試管內，混合均勻做成1:100的稀釋液。另取一支1mL滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋，如此依次稀釋。選擇3個適宜稀釋度，吸取該稀釋度的1mL稀釋液于固體培養基的平皿內，用涂布棒涂布均勻。細菌選擇10-5、10-6、10-7這3個稀釋度涂布，用NA培養基于適宜溫度下培養(表3)。計數，同時做3個平行。

表3 雙孢菇培養料的微生物培養溫度Table3 Culture temperatures of microbes from samples of Agaricus bisporus compost collected during fermentation

1.5.2 霉菌及放線菌總數測定

參照GB/T 13092—1991《飼料中霉菌的檢驗方法》進行測定。霉菌選擇10-1、10-2、10-3這3個稀釋度涂布于PDA培養基平皿，放線菌選擇10-3、10-4、10-5這3個稀釋度涂布于高氏一號培養基平皿，霉菌和放線菌的培養溫度見表3。

1.5.3 培養基的物理感官特征評定

每次取樣時，記錄培養基的氣味、顏色及韌度。其中氣味分為酸味、氨味、霉味及發酵香味4種，強度分為強、中、弱；顏色有棕黃、棕黑、青、白4種；韌性以秸稈能夠承受的最大拉力大小判斷，分為強、中、弱；蠟質去除率以秸稈表面能夠直接被手捻掉的蠟質面積占總表面積的比值計算。

1.5.4 含水量測定

參照GB/T 6435—2006《飼料中水分和其他揮發性物質含量的測定》進行測定。按四分法取樣品5.00g，置于95～105℃干燥箱中，瓶蓋斜放于瓶邊，加熱(4±0.1)h，取出蓋好，放在干燥器中冷卻0.5h，稱其質量。

式中：m1為稱樣皿和樣品的質量；m2為稱樣皿和樣品干燥后的質量；m為樣品的質量。

1.5.5 pH值測定

參照王旭明等[10]的方法測定。準確稱取樣品10.00g，加入100mL重蒸水中，充分混勻后靜置15min，過濾后測濾液的pH值。

1.5.6 硝態氮含量測定

參照GB/T 5009.33—2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》進行測定。采用鹽酸萘乙二胺法測定樣品中亞硝酸鹽的質量，采用隔柱法測定樣品中硝酸鹽的質量，亞硝酸鹽與硝酸鹽的質量和即為培養料中硝態氮的質量，計算培養料干質量中的硝態氮質量。

1.5.7 數據分析

每組測定做3個平行，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS統計軟件(SPSS 13.0)對測定數據進行方差分析(ANOVA)與多重比較分析，組間比較采用t檢驗，并用Excel軟件對數據進行制圖。

2 結果與分析

2.1 雙孢菇培養基中微生物的變化

雙孢菇培養基在工廠化制備過程中，即二次發酵期間細菌、霉菌及放線菌的數量變化如圖1所示。

圖1 發酵期間培養基中微生物數量的變化Fig.1 Changes in microbial numbers during fermentation of Agaricus bisporus compost

由圖1可見，細菌的數量最多，達到108數量級之上；其次是放線菌，達到105～106數量級；霉菌的數量最少，為102～103數量級。當原料浴濕混勻后(f0)，微生物的數量最多，細菌總數為1.45×109CFU/g，放線菌總數為2.09×107CFU/g，霉菌總數為1.20×104CFU/g。進入前發酵階段后培養料的溫度上升至70～80℃，微生物數量下降，嗜熱微生物開始繁殖，其中細菌總數的下降程度最小，在第3次倒料時(f3)為1.50×108CFU/g；放線菌總數在第2次倒料時(f2)下降最多，為8.50×104CFU/g，隨后在第3次倒料時又增加到3.60×106CFU/g；霉菌總數在第2次倒料時下降為50CFU/g，在第3次倒料時又增加到100CFU/g。二次發酵期間(f1～f5)的微生物都是在50℃的高溫下培養的，為嗜熱微生物。第4次倒料(f4)時嗜熱細菌、放線菌及霉菌的數量都有所上升，分別為2.10×109、4.00×106CFU/g和1.50×103CFU/g。而經過后發酵的巴氏殺菌過程，嗜熱的細菌和霉菌數量有所下降，分別變為2.20×108CFU/g和3.70×106CFU/g；而嗜熱霉菌的數量有所上升，為2.40×103CFU/g。

2.2 培養基的物理感官特征變化

雙孢菇的培養料在二次發酵期間物理感官特征的變化如表4所示。結果表明，在前發酵期間的高溫環境下，隨著微生物對于培養基中物質的分解及培養基自身物質的高溫化學反應，使得酸味逐漸減小，氨味先增加后減少，當前發酵結束時(f4)培養基中無酸味和氨味并產生了發酵的香味，后發酵結束時(f5)一些嗜熱霉菌的生長使得培養基的霉味增加。培養基的顏色由黃色逐漸地變為棕黑色，并且隨著放線菌的生長使得培養基中白色的面積增加，后發酵結束后培養基中白色占總面積的60%。隨著發酵的進行培養基中秸稈的纖維被分解，能夠承受的拉力逐漸減小，并且蠟質易去除率增加，到后發酵結束時達到60%，此時的麥秸纖維手捻可散。

表4 發酵期間培養基的物理感官特征變化Table4 Changes in physical and sensory characteristics during fermentation of Agaricus bisporus compost

2.3 培養基的化學成分變化

雙孢菇培養料在二次發酵期間的含水量、pH值及硝態氮含量的變化如表5所示。

表5 發酵期間培養基化學成分變化Table5 Changes in chemical characteristics during fermentation of Agaricus bisporus compost

由表5可見，在二次發酵過程中，含水量呈減少趨勢，由開始的76.8%顯著減少至64.8%(P≤0.05)。在前發酵期間，培養料為堿性，pH值先呈下降趨勢，由7.11降為7.03，但差異不顯著(P＞0.05)，第3次倒料時上升為7.68，與f0差異顯著(P≤0.05)，前發酵結束時(f4)又降為7.40，后發酵結束時又增為7.76。硝態氮含量先由原料浴濕后的35.62mg/kg顯著降低至第3次倒料時的4.23mg/kg(P≤0.05)，然后在第4次倒料時增加為18.77mg/kg，與f0差異顯著(P≤0.05)，后發酵結束時為14.41mg/kg。

3 討 論

工廠化制備雙孢菇培養基是一個非人工加熱而自產熱滅菌的二次發酵過程，通過嗜熱微生物的生長代謝和群落交替作用結合人工對于溫度的控制將培養基中的成分轉化為利于蘑菇吸收、利用的基質[4]。前發酵過程中一些中溫性的微生物生長，利用原料中較為簡單的有機質，產生熱量，料溫迅速上升，使得細菌、放線菌和霉菌的數量都有所降低，同時產生了有機酸使得培養料的pH值隨之下降并且有酸味。隨著料溫的繼續升高，嗜熱微生物開始大量繁殖，因此細菌、放線菌和霉菌的數量在第2次倒料后，開始呈上升趨勢，同時培養基中氨氣使得培養基的pH值開始升高并且培養料開始有刺鼻的氨味。另外由于微生物的降解作用，使培養基中的硝態氮含量減少。同時，在高溫環境下，培養料中的碳水化合物發生焦糖化反應使得培養基的顏色由黃色變為棕黑色，并且隨著嗜熱放線菌的大量繁殖，培養基中呈白色的面積增加。

經過后發酵的巴氏殺菌過程，細菌和放線菌的數量減少，霉菌的耐熱性較強，霉菌數量增加，因此培養基有霉味。由于高溫下水分的揮發，培養基的水分含量一直呈下降趨勢。細菌和真菌能夠降解木質素[11]，因此經過二次發酵后培養料中的秸稈用手捻即可散開。由于培養基中的氨化物被嗜熱放線菌固定，最終以富含氮的木質素-腐殖質復合體的形式存在[12]，因此后發酵結束時硝態氮的含量較前發酵期間顯著增加。

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