抗青霉芽孢桿菌優良菌株的分離、篩選及鑒定

趙一楠，叢 苑，孔維嘉，尚 楠，張 旭，李平蘭*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

青霉可以污染多種果蔬及其制品，是導致柑橘類水果發生腐敗變質的主要原因。青霉主要在采摘及包裝過程中侵染果體，并在貯運過程中導致腐敗變質，是腐敗變質過程中的優勢菌叢[1]。

目前，控制食品腐敗變質的方法主要有物理方法、化學方法和生物方法。物理方法容易影響食品的風味、質地和營養價值；化學防腐劑雖效果顯著，但已有部分殺真菌劑因為可能存在的毒性風險而被禁止使用，此外，特定種類殺菌劑的反復使用也導致了青霉耐藥性菌群的出現[2-3]。而采用生物防腐保鮮劑對采后果蔬進行貯藏保鮮，不但可以避免對食品本身風味等的影響，還能減輕或消除采后果蔬中的化學藥劑殘毒對人體危害的擔憂，更為安全有效。

生物殺真菌劑主要來源于植物、動物及微生物。與植物和動物相比，微生物生長周期短、不受季節限制及代謝物產量大的特點使其成為生物殺真菌劑中的研究熱點。芽孢桿菌營養要求簡單，抗逆性強，在生長過程中能產生多種抗菌物質及酶類，是生物殺菌劑研究中的佼佼者。國內外已有一些利用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等進行柑橘類水果、水蜜桃等防腐保鮮的應用研究[4-5]，主要是利用芽孢桿菌發酵上清液作為保鮮劑，但對果品的顏色產生了一些影響，菌株的安全性也有待考察。因此，尋找來源安全、抑菌譜廣、抑菌物質提取方法簡單的芽孢桿菌用以開發安全、有效的生物防腐保鮮劑顯得十分必要。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品：小蜜橘、進口紅提、荸薺、玫瑰香葡萄、紅提、草莓、木瓜、香蕉、香水菠蘿、甜甜柚、臍橙、四川草莓、櫻桃西紅柿、青提、芒果、雪蓮果、水晶梨、鴨梨、轉色前赤霞珠、全麥面包、亞麻籽面包、山藥、黨參、太子參、陳皮、枸杞、靈芝、薏仁、黃芪、生地。

菌種：LPL40菌株在本研究中篩選分離得到。青霉標菌為實驗室保藏。細菌培養基：LB培養基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2～7.4)；真菌培養基：PDA培養基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖200g/L，自然pH值)，固體培養基中加入20g/L瓊脂粉，121℃，20min滅菌備用。

PCR 反應用的各種試劑(分析純) 上海英駿生物技術有限公司；蛋白胨、酵母膏 北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl、葡萄糖(分析純) 北京化工廠。

DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；TG16W微量高速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；LRH生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；TC512型PCR儀 Barloworld Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離

取1g樣品用無菌研缽研碎并加入到9mL無菌生理鹽水中，充分振蕩，80℃水浴15min，用無菌生理鹽水梯度稀釋后吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培養24～72h，挑取單菌落劃線純化。對已純化菌株革蘭氏染色后鏡檢，確認產生芽孢后保存待用。

1.2.2 抗青霉芽孢桿菌的篩選

青霉的培養及孢子液的制備：青霉接入PDA斜面(180mm×18mm)，28℃培養4d，待孢子充分形成后，每個試管中加入5mL無菌的體積分數0.5% Tween-80溶液，充分振蕩后以血球計數板計數并以無菌水調整至107個/mL，4℃保存。

抗青霉芽孢桿菌優良菌株的初篩：當熔化的PDA培養基降至55℃左右時，按1%的比例加入107個/mL青霉孢子液，使混有孢子液培養基孢子濃度為105個/mL，倒入培養皿，每皿約20mL。待凝固后，將分離自食品的132株芽孢桿菌及實驗室保存的85株芽孢桿菌點種在平板表面。37℃培養8h后，28℃培養3d，觀察芽孢桿菌菌落周圍是否存在抑菌圈并用十字測量法測量芽孢桿菌菌落直徑及抑菌圈直徑。

抗青霉芽孢桿菌優良菌株的復篩：發酵液的抑菌效果測定采用杯碟法，用雙層平板。底層為5mL融化的PDA培養基；上層同初篩平板，定量至15mL。挑取初篩篩選出的抑菌效果好的芽孢桿菌斜面保存的菌株，接入裝有50mL LB液體培養基的300mL三角瓶中，28℃140r/min振蕩培養48h。發酵液在4℃條件下經10000r/min離心10min，再經0.22μm濾膜過濾，無菌濾液杯碟法測定發酵液的抑菌活性。每個牛津杯中加入100μL無菌濾液，4℃過夜后，28℃培養72h后十字交叉法測量抑菌圈直徑，以未接種培養基上清液作為空白對照，每處理3次平行。

1.2.3 菌株LPL40的鑒定

形態學鑒定：挑取少量目標菌株在LB平板上劃線，28℃培養20h后觀察單菌落形態并鏡檢。繼續培養至24h后進行芽孢染色并鏡檢。

生理生化鑒定：生理生化的相關研究包括糖醇發酵、接觸酶、酪氨酸水解、酪素水解、吐溫-80降解、卵磷脂降解、檸檬酸鹽利用、生長溫度范圍測定及耐鹽性等實驗，具體實驗方法參見文獻[6]。

16S rDNA鑒定：用于PCR擴增的引物為通用引物，正向引物16Sf：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物16Sr：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反應體系(25μL)為：10×Buffer 2.5μL、10mmol/L dNTP 2.0μL、10μmol/L引物各2.5μL、Taq酶0.25μL、模板1.0μL、ddH2O 14.25μL，空白不加模板。PCR反應條件[5]為：94℃變性5min；94℃變性30s、54℃引物復性1min、72℃延伸2min，35個循環；最后72℃延伸10min。所得PCR 產物用瓊脂糖凝膠電泳在標準條件下進行檢測后送至北京市擎科生物技術有限公司測序。所得序列利用BLAST程序在GenBank基因庫中進行比對，選取相似性較高的幾株菌株的16S rDNA序列，用MEGA3.1軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離、篩選

從木瓜、柑橘、葡萄、全麥面包、太子參、陳皮等食品及中草藥共計30個樣品中分離得到132株菌落純芽孢桿菌，并分別進行了斜面保藏和沙土管保藏。

通過平板點種法，從分離的132株芽孢桿菌和實驗室保存的85株芽孢桿菌中，初篩出74株有清晰透明圈形成的芽孢桿菌。通過計算抑菌圈直徑與芽孢桿菌菌落直徑的比值來確定抑菌效果，結果獲得18株抑菌效果顯著(抑菌圈直徑與菌落直徑比值大于3)的菌株。其中比值大于4的有3株，比值在3～4之間的有15株，具體見表1。

表1 抗青霉芽孢桿菌優良菌株的初篩結果Table1 Primary screening of Bacillus sp.strains with high antifungal activity against Penicillium sp.

通過對菌種LPL40、LPL43及LPL54進行發酵上清液抑菌活性的測定，發現LPL43上清液沒有明顯的抑菌圈出現，考慮到初篩實驗是青霉與芽孢桿菌共同生長，推斷可能是微生物之間的生長競爭所致。共同生長過程中青霉的存在誘導了LPL43產生抑菌物質。菌種LPL40與LPL54上清液抑菌效果相差不多，LPL40上清液的效果稍好于LPL54。為了定量分析抑菌效果和確定最終的目標菌株，本研究進行了初步的硫銨沉淀實驗并以二倍稀釋法測定抑菌效價，結果顯示，菌株LPL40硫銨沉淀粗提物抑菌效價為1280AU/mL，而菌株LPL54硫銨沉淀粗提物抑菌效價為320AU/mL，因此確定菌種LPL40為最終的目標菌株，具體結果見表2。

表2 發酵上清液的抑菌效果(± s)Table2 Antifungal activity of fermentation supernatants of 3 selected strains with higher antifungal activity against Penicillium sp.(± s)

表2 發酵上清液的抑菌效果(± s)Table2 Antifungal activity of fermentation supernatants of 3 selected strains with higher antifungal activity against Penicillium sp.(± s)

注：－.沒有抑菌圈。

菌種編號 LPL40 LPL43 LPL54抑菌圈直徑/mm 13.94±1.90 － 13.63±0.88

2.2 目標菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態學鑒定結果

圖1 芽孢桿菌LPL40形態學鑒定結果Fig.1 Morphological identification of Bacillus sp.LPL40

由圖1可知，菌株LPL40在LB平板上生長時形成淡黃色半透明圓形菌落，菌落突起，邊緣整齊，表面光滑、黏稠，以接種環挑起時呈拉絲狀，培養基不變色。鏡檢結果表明，該菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，染色均勻，可形成內生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱。

2.2.2 菌株LPL40的生理生化鑒定

菌株LPL40的生理生化鑒定結果見表3。鑒定結果表明，其接觸酶反應、酪素水解、卵磷脂水解成陽性，能夠利用葡萄糖及淀粉，不能在4、10、55℃生長，不能在7% NaCl溶液中生長但能夠在5% NaCl溶液中生長，這些結果與《常見細菌系統鑒定手冊》[6]比對顯示菌株LPL40為解淀粉芽孢桿菌。

表3 菌株LPL40生理生化鑒定結果Table3 Physiological and biochemical characteristics of Bacillus sp.LPL40

2.2.3 16S rDNA同源性的鑒定

LPL40菌染色體DNA用PCR擴增出單一條帶，PCR產物回收純化后經DNA測序，序列長度為1447bp。以16S rRNA序列同源性為基礎構建系統發育樹。菌株LPL40與B.amyloliquefaciens和B.subtilis同源性最高，分別為99.93%和99.34%，使用MEGA3.1計算序列相似性并作系統發育分析，結果如圖2。

圖2 以16S rDNA序列為基礎的菌株LPL40系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Bacillus sp.LPL40 based on 16S rDNA sequence

3 討 論

自1945年Johnson等[7]報道枯草芽孢桿菌產生抗菌物質后，近半個世紀以來各國的研究工作者對它能否成為一種生物控制因素寄予了極大興趣和關注。近年來多篇文獻報道了包括蠟樣芽孢桿菌[8]、地衣芽孢桿菌[9]、多黏芽孢桿菌[10]在內的多種芽孢桿菌均能夠產生活性抑菌物質。

本實驗所選的芽孢桿菌分離自食品及中草藥，主要是考慮到幾下幾個因素：1)青霉主要侵染水果、水果制品及面包等食品；2)新鮮、完整的水果表面存在的芽孢桿菌有可能在延緩水果腐敗變質方面起到一定的作用；3)食品、中草藥源的芽孢桿菌具有一定的安全性。

從本實驗結果可以看出，芽孢桿菌經初篩后有超過1/3的菌株對青霉顯現出了拮抗作用，而經復篩后最終確定的目標芽孢桿菌LPL40菌株，其菌體細胞及發酵上清液均對青霉表現出強烈的抑制效果，通過生理生化實驗及16S rDNA鑒定，確定該菌種為解淀粉芽孢桿菌。但在比對過程中也發現，芽孢桿菌LPL40與枯草芽孢桿菌的相似性也達到99%以上?！恫芗毦b定手冊》[11]把解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌分開，是由于這個種的DNA的G+C的含量為43.5%～44.9%，DNA-DNA雜交僅有15%的同系物，α-淀粉酶的性質不同，產生量很大。解淀粉芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌同源性高，內含很多相同或相似的基因，可以通過部分基因特異性序列分析進行區分[12]，因此，在必要的情況下可以對菌株LPL40進行進一步的鑒定。

目前，國內外學者已分離到對真菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌，研究方向集中在對其抑菌物質的分離、純化上。已被報道的抑菌物質有抗真菌蛋白[13]、脂肽類[14]、幾丁質酶[15]等。本實驗室已對菌株LPL40進行了硫銨沉淀和透析處理，粗提物顯示出了較高的抑菌活性，為進一步研究抑菌物質的成分及其結構奠定了前期基礎。

在研究中還發現，菌株LPL40除了對青霉有顯著抑制作用外，對其他食品腐敗菌如根霉、毛霉、黃綠曲霉，植物病原菌如立枯絲核菌、瓜果腐霉、刺腐霉等均有較為強烈的抑菌效果，并且對辣椒在苗期有一定的促生長作用，顯示出了較為寬廣的應用前景。

4 結 論

本實驗從食品及中草藥共計30個樣品中分離得到132株芽孢桿菌，通過平板對峙法及用杯碟法測定其發酵液的抑菌效果，最終篩選出一株芽孢桿菌LPL40，其發酵上清液對青霉的抑菌圈直徑達到(13.94±1.90)mm，通過形態學、生理生化指標測定及16S rDNA序列分析，最終將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌L P L 4 0(Bacillus amyloliquefaciensLPL40)。

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