導致牛肉干產品霉變菌種的分離及鑒定

姜 荷，程坷偉，屠海云

(1.杭州市質量技術監督檢測院，浙江 杭州 310019；2.維益食品(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215021)

在休閑食品市場上，美味的牛肉干是深受大眾喜愛的食品，市場銷量逐年遞增，而且隨著我國肉制品行業的發展，休閑肉制品的發展也會越來越迅速[1-3]。但是在許多市場上口味和包裝都很出色的牛肉干在保質期內都會出現一定比例的霉變，本研究旨在分離鑒定導致牛肉干產品霉變的霉菌品種，并且根據該菌的生物學特性，指導工業生產采取適當的防治霉變措施。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉干霉變樣取自浙江某工廠留樣。

BX51T-32F01生物顯微鏡(帶數碼相機) 日本Olympus公司；L30ESEM型環境掃描電鏡 荷蘭Philips公司。

1.2 培養基

馬鈴薯-葡萄糖(PDA)培養基、查氏(Czapek)培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、Czapek瓊脂培養基、Czapek酵母瓊脂培養基、麥芽(Wort)瓊脂培養基[4-5]，每種培養基(按質量分數配制)另加20%及40%蔗糖配成相應的各種含蔗糖培養基。

1.3 方法

1.3.1 牛肉干產品霉變霉菌的分離

3種接種方法：1)在無菌接種箱內，用接種環蘸取牛肉丁表面霉菌直接劃線接種于PDA培養基、Czapek培養基、牛肉膏蛋白胨培養基上，28～30℃培養5～7d；2)在無菌接種箱內，挑取一小塊霉變牛肉丁在PDA培養基、Czapek培養基、牛肉膏蛋白胨培養基上方抖動后，讓孢子掉落在培養基上，然后將牛肉丁置于培養基上，28～30℃培養5～7d；3)挑取一小塊霉變牛肉丁浸于無菌水中，洗落表面孢子，制成孢子懸液。用此孢子懸液10倍稀釋法，稀釋成10-2后劃線或涂皿分別接種于PDA培養基、Czapek培養基、牛肉膏蛋白胨培養基上，28～30℃培養 5～7d[6-10]。

配制含30%蔗糖或15%氯化鈉的Czapek培養基使用上述3種方法接種，然后分別置于30、37℃培養5～7d。配制含30%葡萄糖的PDA培養基使用上述3種方法接種，然后分別置于30、37℃培養5～7d。

1.3.2 牛肉干產品霉變霉菌的鑒定

霉變霉菌的培養[4]：將分離的霉菌純化后，三點接種于以上各種培養基上。在25～27℃分別培養3、5、7、1 0、1 4、2 1 d。

觀察霉菌表觀特征[11-14]：菌落形態、顏色；子實體形態特征：取樣制片，用顯微鏡觀察該霉菌子實體形態特征；掃描電鏡觀察其孢子表面結構。

2 結果與分析

2.1 霉菌菌種的分離結果

通過在PDA培養基，Czapek培養基上的培養發現樣品中的一種優勢霉菌(編號2010-F1)為喜高滲透壓的霉菌，菌苔初期白色、淡綠色，后呈綠色，日久色深，橄欖綠，暗灰綠，分離收集后進行菌種鑒定。

2.2 霉菌菌種的鑒定

2.2.1 表觀鑒定結果

優勢霉菌2010-F1菌株在Czapek瓊脂培養基上生長極為局限，25℃培養14d肉眼只能見到一點灰白色的菌絲體及很少的正在形成的分生孢子結構，菌落直徑3～5mm，結果見圖1。

圖1 2010-F1菌株在Czapek瓊脂培養基上培養14d的菌落Fig.1 Colonies of 2010-F1 strain cultured in Czapek agar medium for 14 days

在Czapek酵母膏瓊脂培養基上菌落生長局限，25℃培養14d，直徑3mm，白色至淡白灰色，無滲出物；菌落反面淡黃色，見圖2。

圖2 2010-F1菌株在Czapek酵母膏瓊脂培養基上培養14d的菌落Fig.2 Colonies of 2010-F1 strain cultured in Czapek yeast-agar medium for 14 days

在含20%蔗糖的Czapek酵母膏瓊脂培養基上，25℃培養14d，菌落藍綠色，中間突起，邊緣白色，直徑13mm，反面橄欖色，邊緣白色。優勢霉菌2010-F1在含40%蔗糖的Czapek瓊脂培養基上，25～27℃培養14d菌落直徑可達15～20mm。中心稍突起，其他部分平坦，邊緣白色；質地絲絨狀；具大量的分生孢子結構，初期白色，后綠色；無滲出液；菌落反面呈不同程度的微黃到暗綠色，見圖3。

圖3 2010-F1菌株在40%蔗糖Czapek瓊脂培養基上培養14d的菌落Fig.3 Colonies of 2010-F1 strain cultured in Czapek agar medium with 40% sugar for 14 days

分生孢子頭幼時呈輻射狀，可達85μm或更長；分生孢子梗多發生于基質；孢梗莖(130～250)μm×(4～8)μm，壁平滑；頂囊燒瓶狀，直徑為9～16μm，1/2的表面可育；產孢結構單層；瓶梗(7～9)μm×(2～3)μm；分生孢子近球形，直徑為2.3～3.1μm，壁粗糙，表面凹突不平，見圖4～7。

圖4 霉菌2010-F1的分生孢子頭Fig.4 Conidial head of 2010-F1 strain

圖5 霉菌2010-F1的分生孢子Fig.5 Conidiophores of 2010-F1 strain

圖6 霉菌2010-F1的分生孢子表面結構掃描電鏡照片Fig.6 Surface structure of 2010-F1 strain examined by scanning electron microscope

圖7 霉菌2010-F1的分生孢子頭掃描電鏡圖Fig.7 Conidiophores of 2010-F1 strain examined by scanning electron microscope

菌落在Wort瓊脂培養基上生長局限，25～27℃培養14d形成很少的分生孢子結構，邊緣白色，無滲出液；無氣味；菌落反面無色。優勢霉菌2007-F1在含20%、40%葡萄糖的PDA培養基上，菌落平坦，綠色，絮狀。優勢霉菌2007-F1在以上培養基上，37℃不生長。

2.2.2 分類鑒定結果

根據以上研究，2010-F1霉菌不具有有性型，適高滲透壓的培養特征和產孢結構單層，分生孢子頭輻射狀的子實體形態特征，按照齊祖同[4]的分類系統，該菌屬于曲霉屬(Aspergillus)；曲霉亞屬(Subgen.Aspergillus)；又根據其分生孢子成熟時球形、近球形，少數橢圓形及其掃描電鏡表面結構，可推斷其為帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)。

2.2.3 帚狀曲霉的生物學特性

經鑒定，發霉牛肉干上的主要霉菌為帚狀曲霉，該菌特別嗜高滲透壓，只在干燥的基物上生長，可見于室內灰塵，人的皮膚，光學儀器的玻璃上等處，在很低的水分活度(aw0.75)下也能生長，但是在水分活度0.7以下則生長緩慢[15-17]。

3 討 論

帚狀曲霉常見于室內灰塵，人體皮膚，因此在生產過程中，對牛肉干內包車間的空氣凈化設備需要定期的進行檢查，室內的空氣潔凈等級需要定期的進行測試，這樣可以保證室內空氣的潔凈度，減少空氣帶入帚狀曲霉；對于內包工人進入內包車間前的手部清洗要加大監督管理的力度，確保不通過人體帶入霉菌，同時對工人的工作服要定期的進行清洗，要做到不干凈的工作服不帶入車間，帽子和口罩要做到一次性使用結束要扔掉。原牛肉干的企業內控標準是控制在水分活度0.75以下，而帚狀曲霉在0.75以下仍能生長，在0.70以下其生長才能受到抑制，這就解釋了為什么偶爾會出現霉菌生長的現象。在生產標準控制的時候應該將水分活度控制在0.70以下，并對工藝進行修改，這樣可以有效防止帚狀曲霉的生長。

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