SEA體內殺傷S180肉瘤效果及其細胞因子的測定*

張 云 孫嘉琳 王 雪 馮艷敏 李政楠 張洪娜

目前研究的金黃色葡萄球菌腸毒素A（即超抗原SEA）誘導的細胞毒性T細胞（CTL）對腫瘤細胞有強大的殺傷作用[1]。在臨床實踐中需要能對腫瘤細胞進行特異性殺傷的治療方法，而可選擇性地與腫瘤細胞結合的抗體的出現為腫瘤的生物治療提供了新的選擇[2]。SEA抗腫瘤細胞的體外實驗已經有很多報道，并被證實存在一定的殺傷效果[3]，而小鼠體內腫瘤模型的成功建立為SEA體內殺傷腫瘤細胞的研究提供了便利的條件。本研究利用SEA對小鼠的腫瘤細胞進行治療，證實了SEA的體內殺傷效果，并探討其殺傷腫瘤細胞的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Balb/c雄性小鼠40只，體質量18～22 g，SPF級，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號 SCXK－（軍）－2002－001。隨機分成 4組，SEA 低劑量組（0．05 mg/kg），SEA 中劑量組（0.25 mg/kg），SEA 高劑量組（0.5 mg/kg）和生理鹽水對照組，每組10只，前3組為實驗組。S180細胞為天津科技大學食品學院饋贈。SEA為本實驗提取，生理鹽水注射液、干擾素（IFN）-γ鼠單克隆抗體購自南京金斯瑞生物科技有限公司，山羊抗小鼠SP檢測試劑盒購自上海西塘科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海麥莎生物科技有限公司，蘇木素染色液購自北京賽馳生物科技有限公司，IFN-γ ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腫瘤模型的建立 取凍存復蘇的S180細胞株在5%CO2恒溫培養箱中培養，傳2～3代，取處于對數生長期的瘤細胞，用生理鹽水稀釋成1×107/mL的瘤細胞懸液,取其中0.2 mL對小鼠進行腹腔注射，10 d后，抽取小鼠腹水細胞。腹水細胞傳2～3代后，抽取離心，用生理鹽水洗2次，并稀釋成1×107/mL的瘤細胞懸液，以每只小鼠0.2 mL接種于小鼠右前腋皮下。接種24 h后開始給藥，實驗組每鼠腹腔注射0.2 mL相應濃度的SEA，對照組注射等量生理鹽水，隔天給藥共4次。

1.2.2 腫瘤體積測量 接種后第5天，用游標卡尺開始測量腫瘤大小，連續測量5 d，并記錄下數據。

1.2.3 免疫組化法檢測組織中細胞因子IFN-γ的分布情況 給藥第8天，解剖小鼠并取下腫瘤組織，甲醛溶液固定，石蠟包埋，切5 μm厚的切片，組織脫蠟至水。在組織切片上滴加3%H2O2溶液，孵育15 min,以消除內源性過氧化物酶的干擾;蒸餾水稍洗后，PBS洗5 min；滴加血清封閉液，孵育15min，甩去封閉液，滴加一抗，37℃孵育3 h，然后按二抗試劑盒說明書滴加各工作液，DAB顯色，稍洗后，蘇木精染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化20 s。70%乙醇30 s→80%乙醇30 s→95%乙醇Ⅰ2 min→95%乙醇Ⅱ2 min→100%乙醇Ⅰ3 min→100%乙醇Ⅱ3 min→二甲苯Ⅰ透明7 min→二甲苯Ⅱ透明7 min→中性樹膠封片。顯微鏡觀察結果并拍照。

1.2.4 ELISA法測細胞因子IFN-γ指標 于末次給藥后24h，眼眶靜脈叢取血，每只小鼠取0.2 mL，離心，取上清，并取出腫瘤組織和脾臟，稱質量，計算腫瘤抑制率和脾臟指數。腫瘤抑制率（%）＝（對照組腫瘤質量－實驗組腫瘤質量）/對照組腫瘤質量；脾臟指數=脾臟質量（mg）/小鼠體質量（g）。用 PBS溶液溶解，采用酶標雙抗體夾心ELISA法測定血清、腫瘤和脾臟中IFN－γ的水平。按試劑盒說明書加標準品及上清液，加相應的多克隆抗體，37℃孵育60 min，洗滌后加入辣根過氧化酶標記的抗體，再次孵育，洗滌后加顯色劑，終止反應，492 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，計算出血清樣本IFN－γ含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件，先進行正態性檢驗及方差齊性分析，多組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法進行q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Balb/c小鼠瘤體積及生長曲線 SEA組實體瘤體積均比生理鹽水對照組瘤體積增長緩慢，其中SEA高劑量組與對照組腫瘤體積相差最多，見圖1。

2.2 各組小鼠各項指標比較 見表1。與對照組比較，SEA中劑量組和SEA高劑量組腫瘤質量下降，差異有統計學意義（P<0.05）。而SEA各組脾臟指數反而上升，除低、中劑量組外，各組比較差異有統計學意義，并且各組間隨著SEA劑量的增大，脾臟指數增加，腫瘤質量減少。腫瘤組織中IFN-γ的分布情況見圖2。與對照組比較，SEA各劑量組血清中IFN-γ 均明顯增多，差異有統計學意義（P ＜ 0．05）。并且SEA低劑量組分別與SEA中劑量和SEA高劑量比較，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。SEA高劑量組的抑瘤率高于低、中劑量組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），低、中劑量組差異無統計學意義。

表1 解剖后各組小鼠的各項指標比較（n＝10±s）

表1 解剖后各組小鼠的各項指標比較（n＝10±s）

觹P ＜ 0．05，觹觹P ＜ 0．01

組別對照組①SEA低劑量組②SEA中劑量組③SEA高劑量組④F q①∶②①∶③①∶④②∶③②∶④③∶④0.298 7.513**7.215**腫瘤質量（g）0.816±0.030 0.797±0.017 0.784±0.021 0.457±0.022 561.303**2.610 4.396*49.313**1.786 46.703**44.918**脾臟指數（mg/g）10.317±0.742 16.310±2.854 23.270±1.895 27.517±2.562 35.906**5.074 10.968*14.564**5.893 9.489*3.596 IFN－γ（ng/L）28.431±12.167 34.423±7.828 49.402±3.810 58.674±7.723 37.915**3.918*13.715*19.778**9.797*15.860**8.725**抑瘤率（%）-2.33±1.95 3.92±2.12 44.00±3.21 931.740**---

3 討論

干擾素是由多種細胞產生的具有廣泛生物學活性的細胞因子家族,其功能主要包括抗病毒、免疫調節、抑制細胞增殖、影響細胞分化、抑制血管生成等[4]。IFN-γ主要由活化T細胞產生，在小鼠，由Th1亞群產生。當抗原刺激后T細胞分泌IFN-γ，通常與IL-2的產生相一致。干擾素作為具有較強抗腫瘤活性和免疫調節作用的細胞因子[5],在腫瘤生物治療中占據了較為重要的位置。相信隨著對干擾素生理活性和作用機制的深入認識，可以進一步提高其臨床治療效果，在腫瘤治療領域也將具有更廣闊的應用前景。

本實驗結果顯示，SEA組小鼠腫瘤生長速度明顯低于生理鹽水對照組，治療結束后SEA組腫瘤質量及瘤體積明顯低于對照組，表明SEA可以抑制S180腫瘤細胞的生長。且腫瘤的生長情況與SEA的劑量有關，隨劑量的增大而呈下降趨勢，而實驗中，脾臟指數卻隨SEA劑量的增大呈現上升趨勢，說明SEA殺傷腫瘤的效果與T細胞的激活有關，從ELISA實驗中測得血清中IFN－γ的水平可以看出，腫瘤細胞死亡的原因在于T細胞分泌的細胞因子IFN－γ大量增多，說明超抗原SEA可刺激機體產生殺傷性很強的細胞毒T細胞（CTL）及大量的細胞因子，對腫瘤具有很強的殺傷作用。它們能與多數T細胞結合并為T細胞活化提供信號，而普通抗原只能與少數對應T細胞結合并使之活化[6]。但是由于極微量的超抗原就可激活大量T細胞并大量分泌細胞因子，因此如果在應用時劑量掌握不準，就有可能引起機體免疫調節功能紊亂而產生超敏反應，導致一系列急慢性疾病的發生，如毒素中毒綜合征、風濕性關節炎、風濕熱、川崎病和非特異性皮炎等。超抗原殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也有殺傷作用[7]。對SEA細胞靶向定位殺傷腫瘤細胞技術還有待進一步研究，進而降低SEA的不良反應。

同時對于SEA是否能促進其他因子的分泌，分泌的IFN-γ等細胞因子通過哪條途徑作用于腫瘤細胞等還有待于深入研究，以利用其機制進一步提高其抗腫瘤潛能的途徑和方法；最后,通過基因重組的方法對干擾素蛋白進行改造[8]，可提高其生物學活性，并降低不良反應。

[1] Liyanage UK,Moore TT,Joo HG,et al.Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumormicroenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma [J].J Immunol,2002,169(5):2756-2761.

[2] Forsberg G,Ohlssonk Brodin T,et al.Therapy of human nonsmall-cell lung carcinoma using antibody targeting of a modified superantigen[J].Bri J Cancer,2001,85(1):129.

[3] 許桂蓮，朱錫華,楊勁，等.超抗原SEA誘導T細胞無能的作用機制探討[J].細胞與分子免疫學雜志,2002,18(6):105-107.

[4] Yu J,Tian R,Xiu B,et al.Antitumor activity of T cells generated from lymph nodes draining the SEA-expressing murine B16 melanoma and secondarily activated with dendritic cells[J].Int J Biol Sci,2009,5(2):135-146.

[5] Ushijima T,Sasako M.Focus on gastric cancer[J].Cancer Cell,2004,5(2):121-125.

[6] 許從峰,汪成孝,江之泉,等.超抗原SEA抗腫瘤作用研究進展[J].國外醫學·腫瘤學分冊，2001，28(3):165-166.

[7] Hedlund G,Dohlsten M,Petersson C，et al.Superantigen-based tumor therapy in vivo activation of cytotoxic T cells[J].Cancer Immunol Immunother,1993,36(2):89-93.

[8] Zheng G,Chen A,Sterner RE,et al.Induction of antitumor immunity via intratumoral tetra-costimulator protein transfer[J].Cancer Res,2001,61（22）:8127-8134.