腫瘤壞死因子-α對脂肪細胞脂聯素和炎癥因子mRNA表達的影響*

曹競文 何 慶 張 明 于俊娜 張榕榕 牛文彥

近年來研究發現，白色脂肪組織可以分泌多種影響人體胰島素敏感性和攝食的脂肪因子及炎癥因子[1]。作為最重要的炎癥介質之一，腫瘤壞死因子－α（TNF－α）對許多細胞因子的表達有調節作用。研究發現在肥胖動物模型的血漿中炎性細胞因子TNF－α表達水平明顯升高，肥胖患者和2型糖尿病（T2DM）人群血漿中TNF-α水平也明顯升高,因此肥胖和2型糖尿病被認為是一種慢性低度的炎癥狀態[2]。過度表達的TNF-α在介導胰島素抵抗（IR）中起到了中心介質的作用,但是其導致IR的分子機制目前尚不清楚。本研究旨在探討TNF-α在肥胖-炎癥-IR-T2DM的病理生理過程中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1前脂肪細胞株由加拿大Amira Klip教授惠贈。主要試劑：1－甲基－3－異丁基－黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、胰島素、TNF-α（美國 Sigma公司）、胎牛血清（ISREAL）、DMEM（北京天潤善達生物科技有限責任公司）、TRIZOL@（Invitrogen Technoloyies Ins，USA）、DEPC（美國 Sigma公司，天津鼎天生物技術有限公司進口分裝）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪細胞的培養與分化 使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養基，培養條件為37℃，5%CO2。細胞狀態良好時接種于培養板中，見圖1。待培養板內細胞長滿2 d后加入分化液（含0.5 mmol/L的IBMX、0.25 μmol/L的地塞米松、10 mg/L的胰島素）及含10%FBS的DMEM培養48 h。換以含10 mg/L胰島素的培養液再培養48 h。隨后以含10%FBS的DMEM培養基繼續培養，誘導分化后8 d，90%的3T3-L1細胞呈脂肪細胞表型。一部分分別在加分化液前（第0天）以及加分化液后的第2、4、6、8天提取總RNA行實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR），一部分加入高濃度的TNF-α進行處理后，行實時定量RT-PCR。

細胞呈典型的梭形，胞漿中無脂滴，形態與成纖維細胞相似圖1 3T3-L1脂肪細胞誘導分化前光鏡下表現（×10）

1.2.2 脂肪細胞的處理 將10 μg TNF-α干粉溶于經過濾處理的含0.25%牛血清白蛋白（BSA）的PBS緩沖液1 mL中，配制成10 mg/L濃度的TNF-α儲存液。用TNF-α儲存液處理分化成熟的細胞培養板。6孔板設定空白對照和加入等體積含0.25%BSA的PBS緩沖液對照各1孔，第3~6孔加入TNF-α儲存液，保證TNF-α工作濃度為20 μg/L，設定作用于成熟脂肪細胞的時間分別為0.5、4、8、24 h。每組細胞均設3個復孔。

1.2.3 實時定量RT-PCR 將分化成熟的脂肪細胞和用高濃度TNF-α處理的脂肪細胞分別以TRIzol法提取總RNA。逆轉錄合成cDNA，PCR擴增。實時定量RT-PCR引物見表1。反應體系：最終反應混合物（25 μL），其中含有 2×SYBR Premix EX Taq混合液12.5 μL,0.25 μmol/L上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 5 μL，dH2O 5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（×50）0.5 μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性 5 s，57℃退火10 s，72℃延伸34 s，共40個循環。擴增反應完成后進行熔解曲線分析，反應條件為：95℃ 15 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。熔解曲線分析可觀察擴增后產物的特異性，為防止熔解曲線分析結果呈假陽性，將定量PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據產物分子質量大小進一步鑒定產物特異性。結果判定：記錄目的基因Ct值和內參照基因Ct值，根據實時定量RTPCR相對定量的2-△Ct法計算目的基因表達的相對值，△Ct=Ct目的基因-Ct內參照基因。

表1 實時定量RT-PCR引物

1.3 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學處理，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞分化過程中ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA的表達 ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA在3T3-L1前體脂肪細胞不表達，分化第2天開始顯著表達。ADPN mRNA表達量隨分化時間延長而增加（P<0.05）。PPAR-γ mRNA第4天有所下降，第6天和第8天的表達量差別無統計學意義（P＞0．05），見表 2，圖 2。

2.2 高濃度的TNF-α處理后成熟脂肪細胞中各目的基因的表達

2.2.1 ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA的表達 處理0.5 h后ADPN mRNA表達水平明顯下降，處理0.5、4、8 h后，隨著時間延長ADPN mRNA表達水平逐漸下降，處理8 h后降至最低。處理0.5 h后PPAR-γ mRNA表達水平并未明顯下降，其他各處理組與對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.01），處理4 h后降至最低，見表3。

2.2.2 TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 及 IL-1β mRNA的表達 處理0.5 h后TNF-α mRNA表達水平明顯上升，并于處理4 h后達峰值，處理8 h和24 h較處理4 h后下降，各處理組與對照組相比差異均有統計學意義（P<0.01）。處理0.5 h后，IL-6 mRNA表達水平明顯升高，各處理組與對照組相比差異均有統計學意義（P<0.01）。空白組、對照組和各TNF-α處理組IL-1β mRNA的表達差異無統計學意義（P>0.05）,見表 4。

表2 細胞分化過程中ADPNmRNA、PPAR-γmRNA的表達（n=3s）

表2 細胞分化過程中ADPNmRNA、PPAR-γmRNA的表達（n=3s）

觹觹P ＜ 0．01；表 3、4 同

組別第0天（1）第2天（2）第4天（3）第6天（4）第8天（5）F P 1∶2 1∶3 1∶4 1∶5 3∶4 4∶5 ADPN mRNA 1.000 0±0.000 0 3.603 7±0.272 5 11.921 7±0.501 8 109.020 7±1.777 4 2 167.803 3±13.337 0 75 667.792**0.010 0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 PPAR-γ mRNA 1.000 0±0.000 0 4.171 3±0.173 6 3.356 7±0.337 2 6.146 7±0.710 9 6.821 7±0.205 6 116.941**0.001 0.010 0.001<0.001 0.008 0.095

3 討論

肥胖可增加脂肪組織中巨噬細胞的浸潤和炎性因子（如TNF-α、IL-6）基因的大量表達，進而導致外周組織，包括脂肪組織本身，產生IR，導致T2DM的發生。目前已證實過量的TNF-α可作為炎性介質引起炎癥反應，參與疾病的發生[1]。

PPAR-γ是ADPN最主要的轉錄因子。本研究表明3T3-L1脂肪細胞分化過程中ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA表達明顯增強，進一步證明了脂肪細胞的確是活躍的內分泌細胞[3]，說明隨著脂肪細胞的成熟，PPAR-γ活性可能逐漸增強，導致ADPN mRNA的表達隨脂肪細胞分化成熟而增加，此點與Maeda等[4]的發現一致。

表3 TNF-α對3T3-L1脂肪細胞ADPN mRNA、PPAR-γ mRNA 表達的影響 （n=3s）

表3 TNF-α對3T3-L1脂肪細胞ADPN mRNA、PPAR-γ mRNA 表達的影響 （n=3s）

組別空白組（1）對照組（2）0.5 h 組（3）4 h 組（4）8 h 組（5）24 h 組（6）F P 2∶3 2∶4 2∶5 2∶6 3∶4 4∶5 5∶6 ADPN mRNA 1.000 0±0.000 0 2.214 3±0.051 3 1.358 3±0.049 0 0.650 7±0.071 0 0.459 0±0.036 9 0.524 3±0.075 1 471.792**<0.001 0.001<0.001 0.001 0.004 0.005 0.062 PPAR-γ mRNA 1.000 0±0.000 0 1.394 0±0.049 9 1.159 0±0.043 3 0.166 0±0.017 1 0.228 0±0.023 5 0.188 7±0.040 8 811.664**0.061<0.001<0.001<0.001<0.001 0.002 0.054

表4 TNF-α對3T3-L1脂肪細胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 及 IL-1β mRNA 表達的影響 （n=3s）

表4 TNF-α對3T3-L1脂肪細胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 及 IL-1β mRNA 表達的影響 （n=3s）

組別空白組（1）對照組（2）0.5 h 組（3）4 h 組（4）8 h 組（5）24 h 組（6）F P 2∶3 2∶4 2∶5 2∶6 3∶4 4∶5 4∶6 5∶6 TNF-α mRNA 1.000 0±0.000 0 1.004 0±0.119 0 42.378 7±3.456 3 113.778 3±21.288 5 31.842 7±2.640 0 25.879 7±3.221 9 64.069**0.002 0.005 0.003 0.003 0.009 0.008 0.009 0.186 IL-6 mRNA 1.000 0±0.000 0 3.189 0±0.067 8 59.523 0±7.861 0 43.206 3±2.124 1 26.884 7±1.874 7 62.080 3±9.940 2 76.909**0.007 0.001 0.001 0.002 0.092 0.006 0.034 0.004 IL-1β mRNA 1.000 0±0.000 0 2.715 7±0.465 7 1.630 3±1.158 3 3.913 7±1.804 9 1.928 7±1.568 5 2.767 0±1.762 2 1.826--------

本研究發現高濃度的TNF-α對ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA的表達有明顯的時間依賴性抑制作用。ADPN是一種由脂肪細胞分泌的特異性脂源性膠原樣蛋白，可通過降低組織中三酰甘油濃度，增強胰島素信號轉導通路，激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）途徑，下調糖異生的關鍵酶，抑制TNF-α的分泌等增強胰島素敏感性，從而改善IR。PPAR-γ除了通過ADPN影響IR外，它的激活還可促進葡萄糖轉運體GLUT1、GLUT2、GLUT4的表達,并導致糖、脂代謝及信號轉導途徑中一些關鍵基因表達的改變[5]。因此，TNF-α對 ADPN和PPAR-γ的抑制作用直接影響機體IR。

本研究中以高濃度TNF-α處理成熟脂肪細胞后，TNF-α mRNA的表達開始明顯增加，4 h達峰值后下降，說明TNF-α可明顯增加其自身的表達。過度表達的TNF-α可能通過以下機制引起IR：（1）減少IRS-1的酪氨酸磷酸化，抑制胰島素信號轉導。（2）促進脂肪分解，增加游離脂肪酸，間接影響胰島素敏感性。（3）下調脂肪細胞中多種重要的信號分子或蛋白表達，導致IR[5]。（4）影響轉錄因子PPAR-γ的活性，進而影響脂聯素等靶基因的表達[6]。（5）TNF-α可直接導致胰島β細胞的凋亡[7]。因此，本研究進一步證明了TNF-α是引起IR的重要炎癥因子。IL-6是一種多效能的細胞炎癥因子。本研究顯示TNF-α可促使炎癥因子IL-6 mRNA的表達水平升高，說明TNF-α可誘發脂肪細胞發生炎癥反應，促進某些炎癥因子的合成與分泌，從而進一步加重肥胖患者的慢性炎癥水平，進而導致或加重胰島素抵抗。本研究發現TNF-α使IL-1β mRNA的表達有所增加，但差異無統計學意義，這也與IL-1β mRNA在T2DM的大量表達可能主要是高糖原因的研究觀點相吻合[8]。

由此可見，TNF-α在T2DM發病的炎癥機制和肥胖-炎癥-IR-T2DM的病理生理過程中起著重要作用。TNF-α在脂肪組織或細胞中的過度表達與IR的發生有密切關系。需要指出的是，腹內脂肪積聚被認為是肥胖導致IR的重要環節，即使體質量不增加只要腹內脂肪增加也會發生IR，這可能與腹內脂肪組織的局部缺氧有關[9]。因此，對肥胖（尤其是腹型肥胖）的防治和對于肥胖后慢性炎癥反應的干預，在臨床治療IR中有著重要的意義。

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