黃芪總黃酮對佐劑性關節炎模型大鼠IL-4、IFN-γm RNA表達影響的研究*

陜西中醫學院(咸陽 712046)楊曉航 史傳道 葉崢嶸 賈文鵬

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節滑膜炎為特征的自身免疫性疾病,目前認為輔助性 T細胞(Th)亞群 Th1與 Th2及其分泌的細胞因子平衡紊亂和失調是 RA發病的重要因素[1]。黃芪總黃酮(Flavonoids of ast ragalus,TFA)是中藥黃芪莖葉中提取的有效成分中含量較高的一類單體組分。本次研究是在前期 TFA對 Th1與 Th2相關細胞因子白介素 4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)血清含量影響的研究基礎上[2],進一步開展的 TFA對模型大鼠外周血單個核細胞(PBMC)分泌的 IL-4、IFN-γ轉錄水平影響的研究。

材料與方法

1 實驗動物及分組 Waster大鼠 30只,雄性,10～12周齡,體重約 150～180g,購自第四軍醫大學實驗動物中心。將 30只大鼠隨機分為正常組、模型組、實驗組(治療組),每組 10只。

2 主要儀器與試劑 PCR擴增儀(美國 ABI公司 2720型擴增儀),凝膠圖像分析系統(美國 Bio-Rad公司);Trizol(Invitrogen公司),逆轉錄酶 M-MLV試劑盒 (美國 GIBCO),Taq DNA聚合酶、d NTP(Promega公司),RPMI1640(Hy Clone產品 ),淋巴細胞分離液(d=1.083,中國醫學科學院生物醫學工程研究所生產),引物由上海生工生物公司合成。TFA由成都科倫藥物研究所提供,完全弗氏佐劑(FCA,購自美國 GIBCO),DNA Marker為 DL2000(寶生物公司 )。

3 動物模型制備及處理 適應性喂養 3 d后,在乙醚輕度麻醉下,用微量注射器于右后足跖皮內注射環磷酰胺(FCA)0.1 ml,約 14 d左右可誘發成功佐劑性關節炎模型[3]。模型組:上法造模成功后,第 15 d生理鹽水灌胃 3 m1/次,1次 /d,連續 14 d;治療組:上法造模成功后,TFA 250mg/kg體重灌胃,3 m1/次,1次/d,連續 14 d;正常組:適應性喂養結束后,用生理鹽水灌胃 3m1/次 ,1次 /d,連續 28 d。

4 外周血 PBMC分離方法 在超凈臺中,按無菌操作分離 PBMC細胞。步驟如下:①取 1 ml肝素鋰抗凝血與 1 ml RPM I1640充分混勻;②在干凈的空離心管中加入 2 ml淋巴細胞分離液;③沿管壁緩慢將①中稀釋血 2 ml疊加于分層液面上,保持界面清楚;④2 000 r/min水平離心 15min后,吸取單個核細胞層,置入另一離心管中;⑤加入 5倍體積的 RPMI1640,1 500 r/min離心 10min;⑥棄去上清后,懸浮細胞,加入RPM I1640,再次 1 500 r/min離心 10min;⑦棄上清,懸浮細胞,加入 RPMI1640定容至 1 ml;⑧用RPM I1640將細胞懸液濃度調整到 2×106個 /ml。 所獲細胞懸液用于 PBMC總 RNA的提取。

5 總 RNA制備及逆轉錄反應 見參考文獻[4,5]。

6 PCR反應 在 50μl反應體系中,包括 10×PCR緩沖液 5μl,50mM MgCl2 2.5μl,10mM d NTP 1μl,10uM上下游引物(見表 1)各 2μl,DNA Taq酶 0.4μl,cDNA 4μl,滅菌雙蒸水 33.1μl,充分混勻 ,簡短離心。 反應條件:95℃ 5min,94℃30s,62℃ 30s,72℃45s,共 35個循環,再于 72℃延伸 7min。同時以 β-actin作內參照,擴增產物用 15g/L瓊脂糖凝膠電泳進行,電泳的電壓為 6V/cm,溴化已啶(EB)染色 20min后凝膠圖像分析系統下成像觀察并拍攝。

表1 PCR引物 β-actin、IL-4及 IFN-γ的引物序列[6]

7 RT-PCR凝膠圖像分析 應用 Quantity One軟件(Bio-Rad,USA)進行表達強度分析。結果的判斷以圖像分析軟件讀取的目的電泳帶灰度值與內參照βactin條帶的比值作為目的基因 mRNA的表達量,按下列公式計算:mRNA的表達量(相對強度 relative value,RV)=目的條帶灰度值 /β-actin條帶灰度值[7]。

結 果

大鼠外周血單個核細胞表達 IL-4mRNA、IFN-γ mRNA逆轉錄后再 PCR擴增后電泳結果如附圖所示,擴增產物均符合預期片段大小,內參照條帶清晰穩定。從圖中我們可以看到,模型組 IL-4 cDNA經擴增后條帶亮度低于正常組和實驗組,而實驗組條帶亮度略低于正常組。從 IFN-γ表達情況來看,模型組條帶亮度強于正常組和實驗組,實驗組略強于正常組。利用Quantity One軟件分析各組條帶灰度值,然后通過與內參照比較,公式計算其相對定量結果,從表 2我們可以看到模型組大鼠外周血單個核細胞 IFN-γmRNA的表達明顯高于正常組(P＜0.05),經用藥治療后,實驗組明顯降低,與模型組比較呈顯著性差異(P＜0.05)。大鼠外周血單個核細胞表達 IL-4mRNA的表達模型組顯著低于正常組(P＜0.05),治療后實驗組升高,但與模型組比較無顯著性差異。

討 論

大量研究證實,類風濕性關節炎患者滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的單核 /巨噬細胞、淋巴細胞等通過自分泌或旁分泌的方式產生大量的細胞因子和炎性介質,這些分子相互作用形成了一個細胞因子網絡,其中任何一個環節都可能對類風濕性關節炎的病理過程產生重要的影響,而參與類風濕性關節炎的致病過程[8]。類風濕性關節炎屬中醫痹證之頑痹、骨痹及歷節病等范疇。

附圖 各組 IL-4m RNA表達和 IFN-γm RNA表達

表2 黃芪總黃酮對 IL-4、IFN-γm RNA表達的影響()

表2 黃芪總黃酮對 IL-4、IFN-γm RNA表達的影響()

注:與正常組比較*P＜0.05;與模型組比較**P＜0.05;

分組 n IL-4mRNA IFN-γmRNA正常組 10 1.32± 0.79 0.98± 0.61模型組 10 0.79± 0.46* 1.54± 0.57*實驗組 10 1.02± 0.91 1.17± 0.98**

臨床常見癥狀有關節腫脹疼痛,晚期嚴重可引起關節強直、畸形,功能嚴重受損。黃芪為中醫傳統的益氣藥,有補氣升陽,固表止汗,利尿消腫,托瘡生肌的功效。多數治療類風濕性關節炎的組方中,均有大劑量的黃芪[9],可見黃芪在類風濕性關節炎中的治療作用是得到肯定的。黃芪總黃酮是從中藥黃芪莖葉中提取的有效成分中含量較高的組分。現代藥理作用研究表明,它可增加 T細胞總數及提高 IL-2所誘導的 LAK細胞活性[10];同時對大鼠佐劑性關節炎的治療作用可能與其降低血清 LPO及滑膜細胞產生的 IL-1和 NO有一定相關性[11],但以往涉及 Th1與 Th2細胞亞群平衡紊亂研究較少。 IFN-γ和 IL-4分別是 Th1、Th2細胞分泌的特征性因子,Th1及 Th2細胞通過它們控制下游效應細胞的活性。促炎性 Th1細胞及其分泌的 IFN-γ和抗炎性 Th2細胞及其分泌的 IL-4的失衡,是 RA發病的的重要機制[12]。 IL-4在 RA中的作用,一是促進巨噬細胞黏附到血管內皮細胞上,然后逸出血管,沿趨化梯度移動到炎癥部位;二是通過促進 Th2細胞擴增,抑制 Th1細胞介導的免疫應答,從而抑制 RA患者體內異常的免疫反應。正常機體的 IFN-γ能阻斷 IL-4對 B細胞的增殖作用,此外 IFN-γ具有抑制 B細胞的活化作用[13]。本研究通過黃芪總黃酮調節 Th細胞亞群平衡紊亂,旨在探究類風濕性關節炎與 Th1/Th2偏移的相關性和中藥治療類風濕性關節炎的免疫學機制。實驗結果顯示造模組外周血中 Th2細胞因子表達與對照組比較較低,Th1細胞因子較高,Thl/Th2平衡向 Thl偏移,細胞因子平衡狀態受到破壞,結果與文獻報道相符,證實類風濕性關節炎與 Th1細胞因子有一定相關性。治療組外周血中 Th2細胞因子表達與造模組比較較高,而 Th1細胞因子與造模組比較降低但無顯著性差異,表現為 Thl/Th2平衡的 Thl偏移得到糾正,對糾正 RA的炎性損害有利。綜述以上研究結果顯示黃芪總黃酮具有糾正 RA大鼠外周血中 Th1/Th2平衡偏移的作用,而達到防治 RA的目的。

[1] 徐 巍,沈 波,陳葆國,等.RA患者外周血 CD8+CD28-和 CD4+CD25+調節性 T細胞的表達及疾病活動性指標相關性分析 [J].放射免疫學雜志,2010,23(01):69-72.

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