增殖細(xì)胞核抗原PCNA在大鼠缺血再灌注腦組織中的表達(dá)

陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科 (咸陽 712000) 安小亮 王 瑞

對腦缺血后神經(jīng)元損傷機(jī)制研究中,DNA損傷和 DNA修復(fù)是近年來的熱點。很多研究者發(fā)現(xiàn),腦缺血后不僅發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞的壞死,在缺血周圍,也即所謂半暗帶區(qū)可產(chǎn)生 DNA損傷,由此可以誘導(dǎo)凋亡。

為了修補(bǔ)損傷、保證復(fù)制的真實性,生物體內(nèi)有完善的機(jī)制來調(diào)控 DNA復(fù)制到損傷修復(fù)的功能轉(zhuǎn)換。那么,PCNA在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后 DNA修復(fù)中擔(dān)任何種角色?目前已知的 PCNA最重要的功能是其在核酸代謝中的作用:PCNA作為 DNA多聚酶δ(Polδ)的輔助蛋白,是 DNA復(fù)制合成必不可少的物質(zhì)[1]。許多研究者做了大量這方面的工作。發(fā)現(xiàn) PCNA在其中起了重要作用。有研究者設(shè)計實驗,用紫外線照射 1周齡的小鼠海馬腦片,造成海馬細(xì)胞損傷,發(fā)現(xiàn) PCNA在CA3區(qū)錐體細(xì)胞中表達(dá)增高,該實驗結(jié)果提示,PCNA在神經(jīng)系統(tǒng)中非增生細(xì)胞中的表達(dá)與 DNA的損傷修復(fù)密切相關(guān)[2]。國內(nèi)徐廣潤等設(shè)計光化學(xué)法誘導(dǎo)老齡大鼠局灶性腦缺血實驗,發(fā)現(xiàn)缺血后 2h,PCNA表達(dá)降低,但 24h后在缺血周邊區(qū)有所增強(qiáng)[3]。對大鼠進(jìn)行缺血預(yù)處理后,PCNA陽性細(xì)胞在腦缺血區(qū)表達(dá),與假手術(shù)組相比明顯上調(diào)。提示在局灶性腦缺血再灌注過程中,PCNA參與了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞對 DNA損傷的修復(fù)過程,PCNA蛋白的表達(dá)變化可以影響 DNA損傷的修復(fù)過程,受損神經(jīng)元的功能恢復(fù)與 DNA損傷的修復(fù)程度相關(guān)。本研究主要觀察大鼠在不同程度的腦缺血再灌注后,PCNA的表達(dá)改變極其與凋亡的時相與空間關(guān)系,探討 PCNA蛋白在腦缺血再灌注后DNA損傷修復(fù)中的作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物:健康清潔雄性 SD大鼠,體重 250～300g,來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心.

1.2 水合氯醛(批號:20090613)上海五聯(lián)化工廠。多聚甲醛液(批號:20090723)上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 550E高清晰彩色圖文分析計算機(jī)系統(tǒng),購自德國萊卡.

2 實驗方法

2.1 SD大鼠全腦缺血模型的建立:SD大鼠 60只,同等條件下常規(guī)飼養(yǎng) 1周。按照 Dulsinelli和Brierly方法,采用 4-VO法建立全腦缺血再灌注損傷模型。 IR組:第 1日大鼠以 10%水合氯醛 0.36ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉后仰臥固定,頸部正中切口,經(jīng)胸鎖乳突肌后氣管旁進(jìn)入,顯露雙側(cè)頸總動脈并分離,雙側(cè)頸總動脈留置穿線備用,縫合頸部切口。改俯臥位固定于手術(shù)臺上,保持大鼠頭前傾約 30度,同時用橡皮栓住鼠尾給以輕度的牽拉力,使頸椎伸直便于觀察。枕骨下第一頸椎水平正中切口,逐層分離皮下筋膜及鈍性分離肌肉,注意嚴(yán)密止血,仔細(xì)分離兩側(cè)第一頸椎橫突,暴露第一頸椎橫突上的翼小孔,翼小孔下有兩側(cè)椎動脈通過,用燒紅的探針插入翼小孔,燒灼雙側(cè)椎動脈,使之永久閉塞。操作輕柔、仔細(xì),避免損傷脊髓及枕后三角區(qū)神經(jīng)。之后逐層縫合皮下及皮膚。單籠放置,保持室溫于 20～25℃,并用 60W的白熾燈持續(xù)照射至清醒,期間用數(shù)字電子測溫器間斷測定鼠肛溫,防止體溫下降。密切觀察其蘇醒過程,注意保持鼠呼吸道通暢,直至清醒活動。

第2日(24h后)動物活動后以同樣方法麻醉,仰臥位固定,剪開切口縫線,沿昨日留置線再次游離暴露雙側(cè)頸總動脈,以橡皮筋從雙側(cè)頸總動脈下方穿過并提拉,阻斷血供 6min,注意避免過度牽拉及夾閉頸內(nèi)靜脈,期間密切觀察其生命體征變化,可見大鼠瞳孔散大、眼球蒼白、嘴唇發(fā)紺,呼吸急促(頸總動脈阻斷2min內(nèi)瞳孔不散大者予以剔除)。松開橡皮筋予以血液再灌注后,逐層縫合,單籠放置。將鼠置于 20～25℃的室溫中密切觀察其蘇醒過程,期間注意保持鼠呼吸道通暢,直至清醒活動。 PO組除不凝斷椎動脈和阻斷雙側(cè)頸總動脈外,操作完全同 IR組。

2.2 標(biāo)本制備 :所有實驗大鼠分別于再灌注后2h、6h、 12h、 24h、 48h、 72h定點時間給予 10%水合氯醛 0.36ml/100g腹腔注射麻醉后,用加有肝素的 PBS液 100 ml快速灌注心臟,見灌注成功的大腦整體呈均勻的瓷白色。在視交叉后 1 mm和 4 mm處各切一刀取中間小塊腦組織,將組織塊在 4%多聚甲醛液中浸泡,4℃保存 3d后制備成 5M厚海馬薄片。

2.3 PCNA免疫組織化學(xué)染色:用免疫組化SABC法染色,按說明書操作。

2.4 凋亡細(xì)胞原位檢測(TUNEL法)

2.5 顯微鏡觀察以及陽性判斷:①HE染色,在高倍鏡(40×10)下觀察海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。②免疫組織化學(xué)染色抗原表達(dá),切片中顯示胞核染色為棕褐色顆粒的細(xì)胞為 PCNA免疫組化陽性細(xì)胞,表達(dá)強(qiáng)度以灰度值表示,細(xì)胞核或細(xì)胞漿無著色為陰性。③TUNEL染色,切片中顯示細(xì)胞核有明顯的黃棕色顆粒或斑片為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞,定量分析方法為:光鏡下計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(Apoptosis index,AI)計算方法:每只動物隨機(jī)兩張切片,每張切片觀察 CA1,分別計算各區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。 AI=凋亡細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6 采用德國 Leica-550E高清晰彩色圖文分析計算機(jī)系統(tǒng)對陽性結(jié)果進(jìn)行半定量測定,把選出陽性物質(zhì)賦予棕黃色,得出二值圖,并測出灰度,取平均值。灰度值越高代表表達(dá)水平越低。

結(jié) 果

1 HE染色結(jié)果 PO組高倍鏡下細(xì)胞形態(tài)完整,排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,胞核藍(lán)染,核膜完整,核仁明顯 (圖 1);IR組于再灌注 6h可見 CA1區(qū)部分細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)變化,胞體皺縮或腫脹,24h時大量細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化,48h時出現(xiàn)嚴(yán)重改變,細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯,細(xì)胞周圍間隙增寬,神經(jīng)元數(shù)目減少,排列紊亂,分布不均,核膜界限不清,結(jié)構(gòu)模糊(圖 2),至 72h細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

圖1 PO組48h 海馬CA1區(qū) HE染色(×400)

圖2 IR組48h 海馬CA1區(qū) HE染色 (×400)

2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 PO組 CA1區(qū)僅可見少量凋亡細(xì)胞(表 1);IR組中 CA1區(qū) 2h可見散在的凋亡細(xì)胞,缺血再灌注后 6h CA1區(qū)凋亡細(xì)胞開始增加,24～48h為高峰,至 72h明顯減少(P＜0.05,表 1,圖 3)。

圖3 PO組48h 海馬CA1區(qū) TUNEL染色(× 400)

3 全腦缺血再灌注后 DNA修復(fù)相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá) 已有多項研究證實 PCNA在 DNA修復(fù)機(jī)制中具有重要作用,可能也參與了腦缺血以后神經(jīng)元 DNA損傷的修復(fù)。本研究檢測大鼠全腦缺血再灌注后缺血區(qū)海馬 CA1區(qū)腦組織 PCNA的表達(dá),作為大鼠全腦缺血再灌注后神經(jīng)元 DNA的修復(fù)的觀察指標(biāo)。 PCNA蛋白在 PO組各時間點于 CA1區(qū)均見表達(dá),呈棕褐色位于細(xì)胞核內(nèi)(表 2,圖 4);IR組于再灌注后 2h在海馬 CA1區(qū)即可見表達(dá)下降,再灌注后 6～24h組明顯下降,之后持續(xù)低表達(dá)(P＜0.05,表 2,圖5)。

圖4 PO組24h CA1 PCNA的免疫組化染色(× 400)

表1 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區(qū)凋亡指數(shù)的變化(,%)

表1 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區(qū)凋亡指數(shù)的變化(,%)

注:與 PO組比較 P＜0.05

組別 2h 6h 12h 24h 48h 72h PO 0.24± 0.50 1.50± 0.66 1.51± 0.65 1.57± 0.78 2.13± 0.50 1.66± 0.62 I R 2.55± 0.37 14.43± 4.26* 29.25± 6.09* 41.35± 3.28* 38.93± 7.35* 21.35± 5.08*

表2 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區(qū) PCNA灰度值(,%)

表2 SD大鼠缺血再灌注后各時點 CA1區(qū) PCNA灰度值(,%)

注:與 PO組比較 P＜0.05

組別 2h 6h 12h 24h 48h 72h PO 106.67± 23.50 105.88± 22.95 107.03± 23.44 106.39± 23.45 105.75± 22.86 106.45± 23.15 IR 122.14± 21.38* 138.78± 21.10* 156.35± 20.72* 206.52± 25.40* 201.67± 25.39* 204.54± 25.72*

圖5 IR組 24h CA 1 PCNA的免疫組化染色(×400)

討 論

與腦缺血再灌注損傷中的眾多因素都可以引起DNA損傷,DNA損傷直接關(guān)聯(lián)到細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù),是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,其合成水平反映了細(xì)胞增殖率及 DNA合成率,并與多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子密切相關(guān)。

研究表明,DNA的損傷與修復(fù)在缺血神經(jīng)元的死亡機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,對 DNA損傷修復(fù)的失敗是觸發(fā)缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一[4],在急性腦缺血時,其氧供和能量代謝發(fā)生障礙,并在早期有一個活性氧(ROS)產(chǎn)生的高峰,通過氧化應(yīng)激、游離自由基引起蛋白、脂質(zhì)和核酸的破壞。核酸的破壞可導(dǎo)致基因表達(dá)異常和神經(jīng)元死亡,在生理條件下,ROS能被抗氧化物和抗氧化酶中和,但當(dāng)某些氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度超過抗氧化機(jī)制的防御能力時,就可導(dǎo)致氧化性DNA的損傷;這時體內(nèi)的 DNA修復(fù)機(jī)制啟動(主要包括堿基切除修復(fù)通路和核酸切除修復(fù)通路),當(dāng)修復(fù)成功時細(xì)胞存活,如果 DNA的損傷不能得以修復(fù)時,可啟動調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本實驗采用免疫組化法觀察缺血后不同時間海馬CA1區(qū) PCNA表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn):在 PO組及 IR組的不同時間,大鼠海馬 CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞均有不同程度的表達(dá)。IR組再灌注 6h PCNA的表達(dá)明顯下降,至 24h達(dá)到高峰,并持續(xù)低表達(dá)至 72h,而與此同時,反映神經(jīng)元 DNA損傷的凋亡細(xì)胞數(shù)也相繼明顯增加,至 24～48h達(dá)到高峰;二者之間呈現(xiàn)明顯的一方表達(dá)減弱另一方凋亡細(xì)胞數(shù)增加的負(fù)相關(guān)趨勢,這反映腦缺血再灌注之后 DNA受到損傷的同時,作為參與修復(fù)DNA堿基損傷重要因子的 PCNA的表達(dá)卻明顯下降,并且本實驗中 PCNA表達(dá)的低谷還要早于凋亡細(xì)胞數(shù)的高峰出現(xiàn),提示包括 PCNA在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)也同時受到損害,PCNA的修復(fù)能力和修復(fù)速度都有一定的局限性,可能受很多因素影響;DNA損傷不能及時得到修復(fù)或者不能完全修復(fù),最后就可能造成整個細(xì)胞的不可逆損傷。以上與何洪波等[5]的研究接近一致。

綜上所述,增殖細(xì)胞核抗原 PCNA主要在缺血再灌注后早期即 24h前損傷未積累到嚴(yán)重程度時執(zhí)行抗凋亡的作用,對損傷神經(jīng)元 DNA進(jìn)行修復(fù)。提示我們?nèi)绻茏柚够蜓舆t腦缺血后 PCNA蛋白的減少,將可能提供一些治療機(jī)會以降低神經(jīng)元的損害。因此,今后研究方向可以考慮采取某些干預(yù)措施來阻止或延遲腦缺血后 PCNA的減少,或研究能促進(jìn) PCNA蛋白表達(dá)的藥物,這些方法為臨床防治提供新的思路,將可能在腦缺血損傷中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1] 余 芬,袁秀珠.慢性腦缺血大鼠海馬中 APE、PCNA的表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡.山東醫(yī)藥,2009,49(33)∶279

[2] Maga G,Hübscher U.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA):a dancer with many partners[J].J Cell Sci,2009,116(15):3051-3060.

[3] 徐廣潤,張 ,楊 淵.老齡大鼠局灶性腦缺血后 DNA修復(fù)蛋白:增生細(xì)胞核抗原表達(dá)的研究.卒中與神經(jīng)疾病,2000,7(3):129-131

[4] Adkins DL,Voorhies AC,Jones TA.Behavioral and neuroplastic effects of focal endothelin-1 induced sensorimotor cortex lesions[J].Neuroscience,2004,128(3):473-486.

[5] 何洪波,周華東,陳曼娥,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后增殖細(xì)胞核抗原對神經(jīng)功能缺損的影響.中國臨床康復(fù),2004,8(22):4484