脂肝清沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠非酒精性肝炎影響的實(shí)驗(yàn)研究

西安市第八醫(yī)院 (西安 710061) 馬羽萍 葉峰 趙玲 彭杰 羅改云 黃小正 王勇

臨床研究提示,脂肝清沖劑能改善脂質(zhì)代謝和肝功能,有一定的抗脂肪性肝炎的作用。為此,我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn),旨在探討脂肝清沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠非酒精性肝炎的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用 SPF級(jí)健康 8周齡Wistar大鼠,雌雄各半,體重 180±10g,均購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 實(shí)驗(yàn)材料 脫氧膽酸鈉(中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)制劑公司進(jìn)口分裝);總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、檢測(cè)試劑盒(上海科欣生物技術(shù)研究所生產(chǎn));丙硫氧嘧啶購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;膽固醇購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司;所有中藥材均購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 試劑配制:中藥脂肝清的主要成分:黃芪、杜仲、山萸肉、當(dāng)歸、醋柴胡等,按照各藥在各方中的比例準(zhǔn)確稱取,混勻,加入 10倍量水,浸泡 6 h后加熱煎煮1 h,濾出藥液,再加入 8倍量水,煎煮 1 h,過濾,將兩次煎煮所得藥液合并,水浴濃縮為含生藥 1.50g/ml的液體,滅菌 4度保存,冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?用時(shí)微溫。

3.2 動(dòng)物模型制備:參照王倩等方法[1],建立了大鼠非乙醇性脂肪肝模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為 A、B、C、D共 4組。 其中 A、B、 C組是實(shí)驗(yàn)組;D組是正常對(duì)照組。 A、B、C實(shí)驗(yàn)組以改良的高脂飼料(膽固醇 2%,膽酸鈉 0.5%,丙硫氧嘧啶 0.2%,蔗糖 5%,豬油 10%,基礎(chǔ)飼料 82.3%)喂養(yǎng) 8周,自由飲用清水。正常組以全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng),飲自來水。實(shí)驗(yàn)第 8周造模結(jié)束。實(shí)驗(yàn)室溫度(21～23)℃,相對(duì)濕度 50%～60%。

3.3 分 組:將大鼠稱質(zhì)量后按體質(zhì)量大小編號(hào),根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、中藥治療組(1g/kg),古拉定(還原型谷胱苷肽 )治療組。每組各 15只。各治療組從實(shí)驗(yàn)第二天起灌服藥物,模型對(duì)照組灌服生理鹽水 1ml/100g,正常對(duì)照組灌服等量生理鹽水。

3.4 觀察及檢測(cè)內(nèi)容:①觀察實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、食欲、大小便情況等。②心臟采血,分離血清,測(cè)量 TG、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。③肝勻漿測(cè)定:處死大鼠后迅速取出肝臟,在相同的部位稱取肝右葉 500mg,置于預(yù)冷的異丙醇中冰浴勻漿為 10%的勻漿液,4℃靜置抽提 48h后離心,取血清用酶法測(cè)定TG、TC。④光鏡下觀察:于實(shí)驗(yàn)第 8周末處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)后稱重,常規(guī)消毒后,剖腹取大鼠左、右葉肝組織各一塊,大小約 1cm×1cm×1cm,常規(guī)石臘包埋切片、HE染色(由于肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴在制片過程中被脂溶劑所溶解,故 HE染色的切片中脂滴呈空泡狀);并使用美國(guó) AO公司 Histo STAT856型冰凍切片機(jī),在-18℃下進(jìn)行冰凍切片,切片厚度為 9μm。用 70%酒精洗去冰凍切片的水分,滴入蘇丹Ⅲ染料 20～30min,用 70%酒精洗去多余染料,水洗,水洗至胞核顯藍(lán)色;滴入封片劑封固。脂肪呈橙紅色或鮮紅色,胞核呈藍(lán)色。于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。-:無變性肝細(xì)胞;+:變性肝細(xì)胞占視野＜1/3;++:變性肝細(xì)胞占視野 1/3～2/3;+++變性肝細(xì)胞占視野＞2/3。模型組與正常組比較,P＜0.05,中藥組與模型組比較,P＞ 0.05。

結(jié) 果

1 一般情況 造模結(jié)束時(shí),正常對(duì)照組大鼠飲食、精神和活動(dòng)狀態(tài)良好,體重持續(xù)增長(zhǎng)。脂肪肝模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中皮毛蓬亂而無光澤,精神萎靡、食欲不振、飲水減少、體質(zhì)量下降,大便稀溏,對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍,有互相撕咬、攻擊現(xiàn)象。西藥治療組大鼠反應(yīng)稍差,精神欠佳,個(gè)別出現(xiàn)溏便,體質(zhì)量增加較緩慢。中藥治療組皮毛光澤,行動(dòng)靈活,進(jìn)食量正常,個(gè)別體質(zhì)量增加較緩慢,大鼠反抗力增強(qiáng)。

2 肝濕重及肝指數(shù)(肝濕重 /體重× 100%)變化情況 正常組和模型組大鼠體重明顯增加,但是中藥組和西藥組大鼠體重明顯減輕,差異均有顯著性意義(P＜0.05)。模型組、中藥組和西藥組大鼠的肝臟重量均有增加的趨勢(shì),但僅模型組明顯高于正常(P＜0.05),中西藥組肝臟重量與模型組比較有降低趨勢(shì),但與正常組間比較無顯著性差異。模型組大鼠的肝指數(shù)顯著高于體重相似的正常組(P＜0.05),其余各組肝指數(shù)各組間無顯著性差異 (見表 1)。

表1 肝濕重及肝指數(shù)()

表1 肝濕重及肝指數(shù)()

注:*P＜0.05與正常組比較;△P＜0.05與模型組比較

組 別 n 大鼠體重(g) 肝濕重(g) 肝指數(shù)正常組 15 412.1± 24.1 8.9± 1.2 2.8± 0.2模型組 15 419.2± 22.5* 9.9± 0.9* 3.3± 0.2*中藥組 15 388.3± 24.8* 9.5± 1.5 2.6± 0.2西藥組 15 385.3±28.7 9.1±1.4△ 2.7±0.2

3 血清中生化指標(biāo)的變化 模型組大鼠血清ALT、AST、TC及 TG水平均顯著升高(P ＜0.05)。而同模型組相比,西藥和中藥治療組大鼠血清 ALT和AST水平顯著降低(P＜0.05),而中藥與西藥治療組血清 ALT和 AST水平之間未見明顯差異 (P＞0.05),與模型組比較,中藥及西藥組對(duì) TC及 TG水平均無明顯變化。見表 2。

表2 血清中生化指標(biāo)的變化()

表2 血清中生化指標(biāo)的變化()

注:P＜0.05與正常組比較;△ P＜0.05與模型組比較。

組 別 n ALT(U/L) AST(U/L) TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常組 15 67.5±10.3 78.8±35.4 50.7±0.3 0.9± 0.1模型組 15 113.2±15.2* 180.1± 33.4* 84.4± 1.4* 2.1± 0.4*中藥組 15 84.1± 12.1△ 92.2±23.5△ 78.2± 1.1* 2.3± 0.2*西藥組 15 85.3± 13.3△ 76.5±21.1△ 80.1± 0.8* 2.2± 0.1*

4 組織中 TC,TG水平的變化 肝組織中模型組大鼠 TC和 TG水平明顯升高(P＜0.05),中藥組和對(duì)照組用藥后 TG水平下降,但之間無差異,且仍高于正常且有顯著性差異(P＜0.05)。

表3 組織中 TC,TG水平的變化()

表3 組織中 TC,TG水平的變化()

注:P＜0.05與正常組比較;△ P＜0.05與模型組比較

組 別 n TC(mmol/L) TG(mmol/L)正常組 15 1.2±0.1 1.6± 0.3模型組 15 3.4± 0.3* 2.2± 0.7*中藥組 15 2.6±0.3*△ 1.8±0.4*西藥組 15 2.2±0.2*△ 1.6±0.5*

5 肝臟組織病理分析

5.1 大體觀察:造模結(jié)束后,正常對(duì)照鼠肝臟為紅褐色,形態(tài)正常,表面光亮,中等硬度,切面略有顆粒感,無油膩感;模型組大鼠多數(shù)肝臟表面顏色發(fā)黃,肝臟體積明顯增大,包膜緊張,部分肝臟呈奶黃色,切面油膩,有油滴,無顆粒感;中藥組大鼠肝臟較正常組偏大,大部分顏色紅潤(rùn),個(gè)別淡黃色,切面略有顆粒感,無油膩感;西藥組大鼠部分肝臟肥厚,紅黃相間,個(gè)別切面油膩,有油滴。

5.2 光鏡下觀察結(jié)果:①正常組大鼠肝細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀分布,肝細(xì)胞排列緊密整齊,大小均勻,未見異常增多的紅染脂滴;②模型組大鼠肝細(xì)胞中度水腫,結(jié)構(gòu)紊亂,多數(shù)肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見彌漫性大小不等、數(shù)量不一的紅染脂滴,以小葉中央?yún)^(qū)受累明顯,嚴(yán)重的融合為大脂滴,將細(xì)胞核擠向一邊,形似脂肪細(xì)胞;③中藥治療和西藥治療組:大鼠肝細(xì)胞較正常略大,均較模型組有不同改善。僅有一些細(xì)小脂滴散布于肝小葉周邊的細(xì)胞內(nèi),偶見匯管區(qū)少量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。

5.3 各組大鼠肝組織 HE染色肝細(xì)胞脂肪變性分級(jí)比較:模型組,中藥組,西藥組大鼠變性肝細(xì)胞數(shù)半定量均比正常組明顯增多(P＜0.05)。中藥,西藥治療組大鼠變性肝細(xì)胞數(shù)半定量均比模型組明顯減少(P＜0.05),但二者經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異尚無顯著性(見表4)。

表4 各組大鼠肝組織 HE染色肝細(xì)胞脂肪變性分級(jí)比較

5.4 各組大鼠肝組織蘇丹紅Ⅲ染色脂滴半定量分析比較:蘇丹紅Ⅲ染色結(jié)果:鏡下觀察肝組織脂肪經(jīng)蘇丹紅Ⅲ染色,模型組大鼠肝細(xì)胞變性以大泡性脂滴為主,中藥及西藥組大鼠肝細(xì)胞變性則以小泡性脂滴為主。中藥治療組脂滴明顯比模型組西藥組少,其分布面積經(jīng)圖像分析系統(tǒng)的半定量分析差異有顯著性意義(P＜0.05),見表 5。

表5 各組大鼠肝組織蘇丹紅Ⅲ染色脂滴半定量分析比較

討 論

脂肪肝系由多種原因引起的肝臟脂肪性病變。其中非酒精性脂肪性肝病是一種無過量飲酒史,以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。本研究采用高膽固醇、高脂肪飼料喂養(yǎng)大鼠是目前較為理想的脂肪肝造模方法,其主要特點(diǎn)是人為干擾因素少,飲食結(jié)構(gòu)接近人類日常的飲食,因而研究結(jié)果更具有說服力[2]。本研究造模 8周后,模型組大鼠肝組織的小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞變性,細(xì)胞體積增大,蘇丹紅染色提示肝細(xì)胞中有大量脂滴浸潤(rùn),證實(shí)形成了脂肪肝的病理改變。脂質(zhì)代謝異常是脂肪肝發(fā)生、發(fā)展的主要特征[3]。模型組大鼠的肝指數(shù)顯著高于體重相似的正常組,提示肝臟增大。同時(shí)除肝組織 TC、TG濃度和血清 TC、TG含量外,血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性均比正常組明顯增高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本文復(fù)制的模型存在脂肪肝的炎性損傷。脂肝清治療后肝組織 TC、TG濃度和血清 TC、TG含量,以及反映肝臟炎癥的血清ALT、AST活性均明顯下降,這可能是脂肝清治療脂肪肝有效的原因之一。本研究結(jié)果表明,造模同時(shí)給予脂肝清沖劑及西藥治療,能夠有效地抑制模型大鼠的體重和肝重的增加。其中西藥組大鼠肝臟的濕重較模型組明顯減少;以及中藥,西藥組大鼠的體重均有所下降,且明顯低于正常組,其意義和原因還有待于進(jìn)一步的探討。中藥治療組的肝細(xì)胞變性分級(jí)程度輕于模型組,雖然中藥組肝組織 HE染色肝細(xì)胞脂肪變性分級(jí)較西藥組無顯著性差異,但經(jīng)過蘇丹紅Ⅲ染色的圖像半定量分析結(jié)果顯示,中藥治療組大鼠肝臟油紅染色面積明顯小于模型組,差異顯著。這提示脂肝清能有效減輕大鼠肝組織的脂肪浸潤(rùn)。本研究 HE染色鏡下對(duì)肝組織內(nèi)脂肪含量的僅能進(jìn)行半定量分析,具有一定的片面性,不能準(zhǔn)確反映脂肪肝總體的狀況。而利用圖像技術(shù)對(duì)形態(tài)學(xué)標(biāo)本進(jìn)行定量分析的方法,結(jié)果具有客觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。這可能是造成兩種病理觀察結(jié)果差異的原因。這表明脂肝清能有效預(yù)防非酒精性脂肪肝的形成。

[1] 王倩,管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改進(jìn).世界華人消化雜志,2007,11:1219-1224

[2] 周海濤,洪振豐.脂肪肝的動(dòng)物模型研究進(jìn)展.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,02:68-71

[3] 溫秀梅,陳芝蕓,嚴(yán)茂祥,何蓓暉.大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成中脂質(zhì)代謝的變化.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,9:1987-1989