制川烏配伍白芍微波提取與傳統提取工藝的比較研究

鄭 琴， 郝偉偉， 樂志艷， 陸浩偉， 盧燕香， 楊 明

(江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004)

制川烏與白芍均具有鎮痛、抗炎作用。制川烏發揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質，白芍中主要化學成分芍藥苷。微波提取技術具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低等許多優點，是一種天然產物提取的新技術［1-3］。本實驗以烏頭總生物堿、芍藥苷為指標，用紫外可見分光光度法、高效液相色譜法進行測定，采用正交設計優化工藝，將微波提取法用于制川烏與白芍配伍后烏頭總堿及芍藥苷的提取，通過比較傳統提取法與微波提取法對有效成分煎出量的影響，為微波提取應用于中藥有效成分的提取可行性提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HWC-3LA型微波提取設備(廣州興興微波能設備有限公司);agilent 1200液相色譜儀(美國)，包括:四元梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱、G1314B VWD紫外檢測器;UV-2550型紫外可見-分光光度計(日本島津公司);Sartorius BS124S電子分析天平。

1.2 試藥 制川烏藥材(購自江油恒源藥業集團有限公司，產地:四川，批號:20080930)，白芍藥材(購自黃慶仁大藥房，產地:浙江，批號:20080925)，由中藥鑒定教研室鑒定符合《中國藥典》2005年版。對照品:烏頭堿(購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110720-200410)，芍藥苷(購自中國藥品生物制品檢定所，批號:110736-200629)，乙腈(色譜純，德國MOKER公司)，雙蒸水(自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 烏頭總生物堿的含量測定方法［4］

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿對照品適量，置25 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液，并添加至刻度，搖勻，即得0.149 mg/mL的烏頭堿對照品溶液。

2.1.2 標準曲線的制備 精密量取 0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 烏頭堿標準品溶液，分別置分液漏斗中，各依次加入0.01 mol/L鹽酸溶液 2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.00 mL，各精密加醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，溴甲酚綠液2 mL，氯仿10 mL，振搖3 min，靜置，分取氯仿層，照分光光度度法(附錄V)在416 nm波長處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得回歸方程:A=0.6678 C+0.115，r=0.9998，烏頭堿在0.037～0.298 mg范圍內呈良好的線性關系。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取40目制川烏、白芍藥材粉末，加適量溶劑，分別進行微波和回流提取，提取液離心過濾，精密吸取10 mL，低溫蒸干，殘渣用10 mL蒸餾水溶解，加氨試液調節pH值10～11，用氯仿萃取4次，每次10 mL，合并氯仿液，蒸干，殘渣加0.01 mol/L鹽酸溶液，分次溶解，并轉入25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密量取供試品溶液與空白溶液各2 mL，分別置分液漏斗中，照2.1.2項下方法，自“各精密加醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL”起，依法測定吸收度，計算，即得。

2.1.4 烏頭總生物堿收率的計算 按照《中國藥典》2005年版一部制川烏項下的方法測得制川烏藥材中烏頭總生物堿以烏頭堿計的質量分數為0.45%。

烏頭總生物堿的收率=提取液中烏頭總生物堿的質量/制川烏藥材中總生物堿的質量×100%

M0為提取液中烏頭總生物堿的質量;M1、M2分別為制川烏和白芍的生藥材量。

2.2 芍藥苷的含量測定方法

2.2.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠柱Hypersil ODS 2 C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水(15∶85);柱溫:30℃;檢測波長:230 nm;流速:1.0 mL/min。

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取芍藥苷標準品適量，用50%甲醇溶解，配制40.80 μg/mL的芍藥苷標準品母液。分別準確吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的對照品母液，置 1 mL 棕色量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，制得6個不同濃度的對照品溶液。取上述濃度對照品溶液，按2.1.2項下色譜條件分別進樣10 μL分析。以芍藥苷的濃度(μg/mL)為橫坐標X，平均峰面積(A)為縱坐標Y，得回歸方程 Y=25.924X-3.2414，r=0.9995，結果表明芍藥苷在0.408～40.8 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取40目制川烏、白芍藥材粉末，加適量溶劑，分別進行微波和回流提取，提取液離心過濾，精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，用65%乙醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 測定 精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積，按標準曲線方程計算芍藥苷的質量濃度。

2.2.5 芍藥苷收率的計算 按照《中國藥典》2005年版一部芍藥苷項下的方法測得白芍藥材中芍藥苷的質量分數約為1.63%。

芍藥苷的收率=提取液中芍藥苷的質量/白芍藥材中芍藥苷的質量×100%

M0為提取液中芍藥苷的質量;M1、M2分別為制川烏和白芍的生藥材量。

2.3 浸膏得率的測定

精密量取提取液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，按下式計算浸膏得率。

W為10 mL藥液的浸膏重量;V為提取液的體積;W0為藥材重量。

2.4 制川烏白芍微波提取

2.4.1 實驗因素與水平設計 分別選擇微波功率、提取時間、提取溶劑濃度、溶劑用量作為四因素，進行三水平實驗，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4.2 微波提取的正交實驗 按表2 L9(3)正交表設計的順序進行微波提取。每份樣品提取兩次，合并提取液。精密量取適量提取液，照2.1～2.3項下烏頭總生物堿、芍藥苷及浸膏得率進行測定，測定結果見表2。方差分析結果見表3。

實驗結果表明，直觀分析:影響烏頭總生物堿含量的各因素作用的主次為A＞D＞C＞B，影響芍藥苷含量的各因素次序為:C＞B=A＞D，影響浸膏得率各因素次序為:C＞D＞A＞B;方差分析可見:對烏頭總生物堿為指標性成分影響因素A、D存在顯著性差異，對芍藥苷及浸膏得率各因素不存在顯著性影響，綜上所述:確定提取工藝為A3B2C2D3:提取功率為:800 W，提取時間為:30 min，提取溶劑:65%乙醇，溶劑用量為10倍量。

表2 L9(34)正交試驗設計表及結果

表3 方差分析

(續表3)

2.5 制川烏白芍回流提取

2.5.1 實驗因素與水平設計 分別以提取時間、溶劑濃度、溶劑用量、提取次數作為四因素，進行三水平實驗，因素水平表見表4。

表4 因素水平

2.5.2 傳統回流提取的正交實驗 按表5L9(3)正交表設計的順序進行回流提取。精密量取適量提取液，照2.1～2.3項下烏頭總生物堿、芍藥苷及浸膏得率進行測定，測定結果見表5。方差分析結果見表6。

實驗結果表明，直觀分析:影響烏頭總生物堿含量的各因素作用的主次為C＞D＞B＞A;影響芍藥苷含量的各因素次序為:D＞A＞B＞C;影響浸膏得率各因素次序為:D＞B＞A＞C;方差分析可見:因素C、D對烏頭類生物堿有顯著性影響，而對其他指標性成分影響不顯著。實驗同時考慮到與微波提取工藝的可比性，確定最佳工藝為:A3B2C3D2，即提取時間:2 h，溶劑濃度:65%乙醇，溶劑用量10倍量，提取次數2次。

表5 L9(34)正交試驗設計表及結果

表6 方差分析表

2.6 驗證實驗 按比例稱取制川烏、白芍藥材，分別按微波提取和傳統回流提取的最佳提取條件提取，測定。結果見表7。

表7 工藝的驗證及提取率比較

從表7可以看出，與傳統提取方法相比，微波提取所需時間縮短7倍、溶劑的用量減少了1倍，烏頭總生物堿的轉移率為0.94倍，芍藥苷的轉移率提高到1.68 倍。

3 討論

通過正交設計優化得到微波與傳統提取制川烏配伍白芍的工藝條件，并經驗證得出烏頭總生物堿微波提取法的平均收率為80.31%，傳統回流提取法為 85.13%;微波提取法芍藥苷平均收率為45.51%，傳統回流提取法為26.94%。試驗結果表明，對烏頭總生物堿而言，微波提取略比傳統回流方法的提取率低，但微波提取法芍藥苷的轉移率是傳統提取法的1.68倍，且微波提取法與傳統的熱回流法相比，大大縮短了提取的時間，節省了提取溶劑的用量，從而減低了生產成本。芍藥苷對光、熱不穩定，傳統的熱回流提取工藝，傳熱速度慢，易造成芍藥苷在加熱過程中慢慢分解。微波提取法具有快速提取的優點，減少了提取物在高溫下的受熱時間，從而有利于減少芍藥苷類物質的分解。

微波提取技術已應用于生物堿類、蒽醌類、黃酮類、皂苷類、多糖、揮發油、色素等成分的提取。微波萃取技術作為一種新型的萃取技術，具有一定的適用范圍，如微波對物質提取的選擇性，以及對溶劑要求等方面。Ganzler K［1］等研究表明用極性溶劑提取極性物質，微波法比索氏等其他提取方法理想;但用非極性溶劑提取非極性物質微波提取并未顯示優越性。

［1］Ganzler K，Salgo A，Valkok.Microwave extraction-a novel sample preparation method for chromatography［J］.J Chromatogr，1986，(371):299-306.

［2］龔盛昭，楊卓如.微波萃取黃芩甙的協同效應研究［J］.精細化工，2003，20(7):435.

［3］龔盛昭，程 江，楊卓如.微波場協同提取蘆丁［J］.精細化工，2003，20(12):758.

［4］王蘇會.抗風濕顆粒的制備工藝及質量標準研究［D］.北京:北京中醫藥大學，2005.