高效液相-熒光檢測法測定烏靈膠囊中14種氨基酸的含量

何新榮， 劉 萍

(中國人民解放軍總醫院藥品保障中心中藥房，北京100853)

烏靈膠囊為發酵烏靈菌粉制成的膠囊，其主要的成分是腺苷、多糖、多種氨基酸，其中有多種為人體不能自身合成的必需氨基酸。《中國藥典》收載了其質量控制標準為高效液相色譜法測定腺苷的含量(為新增的方法)和紫外分光光度法測定多糖的含量［1］。查閱烏靈膠囊相關文獻［2-6］，氨基酸類成分是烏靈膠囊的主要成分之一，但關于其相關含量測定研究甚少。為了更科學地控制烏靈膠囊的質量，本實驗對烏靈膠囊中多種氨基酸的含量進行了定量測定，為其質量控制提供科學有效的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國)，G1329A自動進樣器，數據由Agilent Chemstation on-line系統處理，G1315D熒光檢測器(FLD)，色譜柱為 Alltima C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。電子天平(Sartorius CP225D);PHS-2C計(上海虹益儀器儀表);KQ2200DB型數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器)。

1.2 試藥 天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Iso)、亮氨酸(Leu)、胱氨酸(Cys)、色氨酸(Try)、賴氨酸鹽酸鹽(Lys-HC)對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:624-200104);γ-氨基丁酸(γ-GABA，026K0736);烏靈膠囊(浙江佐力藥業股份有限公司，批號:20071203，20071204，20080306，20080308);磷酸氫二鈉、鄰苯二甲醛(phthalaldehyde，OPA)、2-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，2-MCE)均購于Sigma公司;甲醇為國產色譜純試劑;硼酸、磷酸等均為國產分析純試劑。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為 A:磷酸氫二鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH=6.86)，B:甲醇;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;發射波長:340 nm，檢測波長:450 nm。梯度洗脫溶劑比例見表1。

表1 梯度洗脫溶劑比例

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取14種氨基酸對照品，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，配成每1 mL含氨基酸200 nmol/mL標準混合溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取4個批號烏靈膠囊各10粒，傾出內容物，研勻，分別取0.5 g，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加20 mL 0.1 mol/L HCl溶液，超聲振蕩提取20 min，放冷，過濾，濾渣再用20 mL 0.1 mol/L的HCl溶液超聲提取20 min。合并兩次提取液，用雙蒸水定容至50 mL，濾過，濾液再用0.45 μm微孔濾膜濾過，續濾液作為待測樣品，備用。

2.4 衍生試劑的制備 精密稱定12.5 mg OPA，0.25 mL甲醇溶解后，加入2.5 mL 硼酸緩沖液(0.4 mol/L，pH=9.5)，蝸漩混勻，再加入 10 μL β-巰基乙醇，冰箱中保存備用。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系 取2.2項下標準品試液、0.1 mol/L 鹽酸溶液稀釋成 6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/mL。按2.1 項下色譜條件，柱前衍生法進樣5μL進行檢測，以氨基酸峰面積(A)為橫坐標，氨基酸濃度(C)為縱坐標運用Agilent校正功能進行線性回歸，回歸方程詳見表2，結果表明，14種氨基酸均在一定檢測濃度范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5.2 精密度實驗 混合標準品溶液，按2.1項下色譜條件，柱前衍生法(編輯Agilent1200進樣程序，先抽取衍生試劑，接著抽取供試品試液，混合后靜至2 min，進樣)進樣5次，進樣量5 μL。記錄14種氨基酸峰面積和保留時間，其RSD分別為0.18%～1.32%和0.21% ～2.09%。表明精密度良好。

表2 氨基酸的標準曲線

2.5.3 重復性實驗 按照2.3項下制備樣品溶液的方法平行制備5份樣品溶液，分別按照2.1項下色譜條件，柱前衍生法進樣5μL。記錄14種氨基酸峰面積和保留時間，其RSD分別為0.21% ～2.12%和0.31% ～2.14%。表明重復性良好。

2.5.4 穩定性實驗 烏靈膠囊樣品提取液分別于提取后 0、30、60、90、120、150 min(柱前衍生法)進樣，記錄各種氨基酸的峰面積，計算峰面積的RSD為0.42% ～1.87%，顯示烏靈膠囊的鹽酸水提液中氨基酸在150 min內基本穩定。

2.5.5 回收率實驗 采用加樣回收試驗。取6份已知氨基酸含量的烏靈膠囊粉末，各加入對照品溶液按2.3項下處理樣品，衍生后測定，計算回收率。各氨基酸的回收率在90.34% ～99.52%之間，RSD為0.80% ～1.99%。

2.6 樣品含量分析

將2.3項下制備的供試液，按2.1項下色譜條件，在線柱前衍生法進樣。

圖1表明，15種氨基酸都存在于烏靈膠囊中，除His與Gly不能分離開外，各氨基酸分離度較好，空白雜質峰(衍生劑峰)對測定無影響。從表3中含量數據可知，γ-GABA含量最高，Met含量最低。其中以His計 His與Gly的含量，大部分氨基酸在4個批次中的含量標準偏差較小，表明各批次樣品含量控制穩定，也說明了本方法有很好的實用性。

圖1 氨基酸標準品A、烏靈膠囊樣品B與空白對照組C的HPLC-FLD色譜圖

3 討論

在植物藥中氨基酸是重要的有效成分，其中谷氨酸可促進人體內消化液的分泌，具有預防貧血及解毒作用;精氨酸可控制體內細胞的退化;胱氨酸是毛發的成分，具有促進毛發生長和防止皮膚老化作用，也可用于抗過敏、肝炎、白血球減少等癥;蘇氨酸在人體內有轉變氨基酸達到平衡的作用［7］;特別是γ-GABA，作為腦中抑制性神經遞質，是腦內睡眠覺醒系統的物質基礎，有可能是烏靈膠囊發揮鎮靜、安神作用的重要基礎物質，因此正確地利用和進一步研究監控這些氨基酸，對充分發揮烏靈膠囊等靠氨基酸發揮治療作用的藥物價值具有重要意義。

OPA衍生化方法是目前使用較為廣泛的衍生技術［8］，具有樣品制備簡單、衍生化反應迅速、容易實現自動化操作和靈敏度高的優點。試驗中發現，其pH值大小在本實驗中至關重要，OPA衍生化反應要求pH＞9，因為在pH 5～6時衍生產物最易降解［9-11］。

本實驗采用HPLC-FLD法，柱前衍生進樣對4個批次烏靈膠囊中14種氨基酸的含量進行測定，結果準確，精密度高，重現性好，操作較為簡單方便，尤其是流動相較其他報道文獻［3，6］有了很大改進，避免了復雜的流動相配制工作，因此本方法可用于烏靈膠囊中氨基酸的含量測定。同時我們也對烏靈膠囊中其它氨基酸進行了檢測，可能由于不含或含量低，未能檢測出。

表3 4批次烏靈膠囊中氨基酸的含量測定結果

［1］中國藥典［S］.一部.2005:397.

［2］吳強恩，鄭力行.反相高效液相色譜熒光法測定大鼠腦組織中氨基酸類神經遞質［J］.復旦學報:醫學版，2005，32(3):355-358.

［3］張孝松，儲著銀，黃 龍.柱前衍生-反相高效液相色譜分析復方氨基酸注射液［J］.藥物分析雜志，1996，16(1):6-9.

［4］裘 濤，陳 眉，陶水良.烏靈菌粉對腦卒中后抑郁大鼠海馬區單胺類神經遞質及行為學改變的影響［J］.中國新藥雜志，2007，16(11):857-860.

［5］廖名龍，郁 杰.烏靈膠囊［J］.中國新藥雜志，2000，9(11):797-799.

［6］陳宛如，方鴻峰，馬志章，等.真菌中藥烏靈參化學成分的初步研究［J］.中國藥學雜志，1990，11(25):847-849.

［7］岳云飛，王振月，王謙博.柱前衍生反相高效液相色譜法測定毛脈酸模根中氨基酸的含量［J］.時珍國醫國藥，2007，18(9):2069-2070.

［8］Tcherkas YV，Kartsova LA，Krasnova IN.Analysis of amino acids in human serum by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.Chromatogr A，2001，913:30.

［9］盛國慶，張晉蓉，顏 梅.高效液相測定氨基酸類神經遞質的方法探討［J］.徐州醫學院學報，2002，20(1):34.

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［11］Ibolya MP.Derivatization and chromatographic behavior of the ophthaldialdehyde amino acid derivatives obtained with various SH-group-containing additives［J］.Chromatogr A，2001，913:283.