五味子多糖分級注射劑的分級含量和性質(zhì)測定研究

蔡亞平， 韓學(xué)忠

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，人文與管理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

五味子為木蘭科五味子Schisandra chinen sis(Turca)Baill干燥成熟的果實，主產(chǎn)于我國東北地區(qū)故習(xí)稱“北五味子”，具有斂肺、、益氣生津、補腎寧心、收汗?jié)茸饔谩，F(xiàn)代研究證明五味子多糖注射用藥的療效是其口服的100倍之多［1］，但截止目前為止還沒有合格的五味子多糖注射劑應(yīng)用于臨床的報道。究其原因諸多，其中五味子多糖在水溶液中極不穩(wěn)定產(chǎn)生渾濁和沉淀，降低藥效活性物質(zhì)的含量，是其不符合注射劑藥用質(zhì)量要求的重要原因之一。因此，依據(jù)五味子水煎煮法提取的五味子多糖是一個分散體系的性質(zhì)，進行分級處理。除去沒有藥用價值或藥用價值很小的較大分子量多糖，保留經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證明具有主要藥用價值較小分子量的五味子多糖［2］。對其含量和性質(zhì)進行測定研究，探索五味子分級多糖在水溶液中的變化規(guī)律及其本質(zhì)，為符合藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的五味子多糖分級注射劑的研制提供依據(jù)，提高五味子的藥用價值和經(jīng)濟價值。

1 儀器與藥品

實驗用五味子購于哈藥集團世一堂中藥飲片公司，經(jīng)鑒定為北五味子;GOA型電熱真空干燥箱(天津東郊機械加工廠);RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，TU-1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，TD5A臺式多架離心機(長沙英泰儀器有限責(zé)任公司)，芬蘭可調(diào)試移液器(1000 μL)，QL-901旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，烏氏粘度計，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 五味子多糖含量分析方法的建立

2.1 苯酚溶液的配制

取苯酚 100 g，加鋁片 0.1 g 和 NaHCO30.05 g，蒸餾，收集182℃餾分，稱取7.5 g，加蒸餾水150 mL溶解，置棕色瓶內(nèi)，放冰箱備用。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取100 mg干燥失重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，定容至100 mL量瓶中，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［3］

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、2、3、4、5 mL 至量瓶中，分別用蒸餾水定容至 100 mL。制成 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL濃度的稀釋液。使用移液器分別移取1 mL稀釋液，置于5只支10 mL量筒中，加入2 mL苯酚溶液，混合均勻后，加入5 mL濃硫酸，冷卻至室溫，另以1 mL蒸餾水同上操作為空白對照，在490 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程:A=8.77C-0.0169(C:mg/mL，r=0.9997)，實驗證明，C在0.01～0.05 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗

取2.3 項下的0.03、0.04、0.05 mg/mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖稀釋液各3份，按照2.3項下的要求分別測定其吸光度，得RSD分別為1.62%，1.92%，1.84%，證明該測定方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取五味子多糖溶液1 mL，分別取4份，按照2.3項下要求操作，分別在 1、2、3、4、5、6、7、8 h，在 490 nm 下測定吸收度。結(jié)果表明，供試品溶液在顯色后5 h內(nèi)吸光度保持穩(wěn)定。RSD 為0.58%，0.23%，1.96%，1.57%，結(jié)果表明五味子多糖溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗

取五味子多糖供試品溶液6份，每份0.5 mL，分別加入2.3項下的無水葡萄糖對照品溶液0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的含量測定方法，測吸光度，計算回收率，6次的回收率分別為 103.8%、99.62%、101.2%、99.65%、99.58%、102.45%，RSD=1.74%(n=6)。

2.7 多糖的含量計算

多糖是多個單糖縮合在一起的高分子化合物，我們假設(shè)每一個單糖都是葡萄糖，當(dāng)兩個葡萄糖縮合在一起，就失去一分子水，三個葡萄首尾相連糖縮合在一起就失去三分子水，以此類推，n個葡萄糖首尾相連縮合在一起，就失去n分子的水，即失去了原來葡萄糖總質(zhì)量的10%，所以我們近似地得出多糖含量計算公式為:mi=0.9mg，mi為多糖的質(zhì)量，mg為葡萄糖的質(zhì)量，運用此公式，以葡萄糖為對照品，就可近似的計算出多糖的含量變化趨勢。

當(dāng)然我們的計算結(jié)果并不能夠直接反映出多糖的實際含量，因為多糖中還含有其它種類的單糖，所以這種運用硫酸-苯酚法對多糖的定量測定，只能把多糖中參與硫酸-苯酚顯色反應(yīng)的單糖全都折算成是相當(dāng)于多少葡萄糖參與了顯色反應(yīng)，并不能夠?qū)Χ嗵呛窟M行定量計算，只能反映出多糖沉淀隨醇濃度增加的含量變化趨勢。

3 多糖的提取純化［4］

稱取干燥的五味子100 g，用1000 mL蒸餾水浸泡2 h，加熱至沸，微沸30 min，過濾，再加入500 mL水煎煮25 min，過濾，將2次濾液合并，濃縮至每1 mL含有0.2 g五味子的量為止。加入無水乙醇使其濃度達到80%(v/v)，并恒溫25℃條件下放置4 h，離心沉淀，將沉淀溶解于500蒸餾水中，再加入無水乙醇使其濃度達到80%，醇沉4 h后，離心，兩次水溶醇沉后的沉淀物即為五味子粗多糖。

4 五味子多糖的分級

采用恒溫沉淀分級法，將2.2 g多糖溶于純凈水，500 mL量瓶定容，待充分混勻后，制成五味子多糖的飽和液，離心除去少量膠狀沉淀后，取9份20 mL的五味子多糖飽和液，分別置于9個錐形瓶中，再分別加入無水乙醇，使溶液中乙醇濃度達10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，得到膠狀沉淀，將沉淀分別用3 μm微孔濾膜過濾，用少量水溶解，定容至一定體積的量瓶中，按照2.3項下操作，對沉淀中的多糖進行含量測定。不同級分的沉淀中多糖的含量測定結(jié)果見表1，圖1。

表1 不同級分的沉淀中多糖的含量

圖1 不同級分沉淀中的多糖的含量解析圖

5 多糖的性質(zhì)測定［5］

5.1 兩部分多糖的外觀差異

高分子量部分的多糖，潮濕狀態(tài)下呈現(xiàn)深紫色的半透明凝膠狀，黏性極高;干燥狀態(tài)下呈現(xiàn)黑色半透明顆粒狀。低分子量部分的多糖，潮濕狀態(tài)下呈現(xiàn)粉紅色的石灰漿狀，不具有黏性;干燥狀態(tài)下呈粉白色石灰狀。

5.2 溶解度和溶解速度

稱取高分子量和低分子量多糖各2.5 g，分別溶解于50 mL水中，超聲1.5 h溶解后，冷卻至室溫，離心后稱量沉淀的重量，與原來重量之差測量溶解度。最后得到高分子量多糖的溶解度為0.96%，低分子量多糖的溶解度為2.61%。

取20 mg高分子量多糖，置于于25 mL水中，超聲25 min溶解;取20 mg低分子量多糖，置于25 mL水中，超聲9 s溶解。直觀上低分子量多糖得到清澈透明的溶液而高分子量溶液是渾濁液。

5.3 黏均分分子量

5.3.1 較高分子黏均大分子量

取高分子量多糖的飽和液，分別用移液管吸取5、8、9、10 mL，稀釋至25 mL，連同飽和液一起，在20℃用烏氏粘度計測定其黏度。

5.3.2 較低分子黏均分子量

取低分子量多糖的飽和液，分別用移液管吸取5、8、9、10 mL，稀釋至25 mL，連同飽和液一起，在20℃用烏氏粘度計測定其黏度。

通過ηsp/C-C的直線公式，分別得到了高分子量多糖和低分子量多糖的特性黏度［η］，分別是73.146和4.8464。根據(jù)公式［η］=KMα，通過查閱資料，我們知道直鏈淀粉在20℃水溶液中的數(shù)據(jù)，K=13.2 ×10-3cm3·g-1，α =0.68，把這組數(shù)據(jù)代入公式中，得到高分子量多糖和低分子量多糖的黏均分子量分別為3.185×105和5.892 ×103。

6 討論

以上實驗數(shù)據(jù)表明，隨著乙醇濃度的不斷提高多糖的沉淀量也逐漸增加，沉淀速度也呈現(xiàn)出先快后慢的質(zhì)性。當(dāng)乙醇的濃度提高至40%時沉淀明顯地處于停滯狀態(tài)，沉淀量也從1.73781 mg降到0.52335 mg。而當(dāng)乙醇的濃度高于40%以上時，隨著乙醇濃度的提高多糖的沉淀量直線增加，線性關(guān)系良好，r=0.9996。當(dāng)乙醇的濃度達到80%以上時再也沒有沉淀析出。根據(jù)五味子多糖的溶解性質(zhì)可知，乙醇濃度40%以下時析出的是較大分子量的多糖，而乙醇濃度達到40%以上時析出的是分子量較小的多糖(單糖、低聚糖)，所以40%以上的乙醇濃度是所需分級提取的分界濃度。所獲得的兩部分含量分別是22.9%與77.1%，較小分子量多糖高出54個百分點，顯然這是一個比較理想的分級結(jié)果。

通過黏均分子量、溶解度和溶解速度等性質(zhì)測定，給出的數(shù)據(jù)客觀地反映出兩部分多糖的性質(zhì)差異。較小分子量溶解度為2.61%，常溫下20 min即得到清晰透明的溶液;而較大分子量多糖放置4 d仍然存在大量懸浮物，溶液渾濁不清。在同樣的超聲條件下，較大分子量多糖溶液4 h后仍與常溫4 d的狀況相仿;而較小分子量僅9 s就得到清晰透明的溶液。這種在溶解度和溶解速度上表現(xiàn)出的差異，兩者十幾萬的黏均分子量差距給出了合理的解釋。

綜上所述，采用分級提取的方法制備五味子多糖注射劑，較好地解決了由于大分子量多糖的存在直接導(dǎo)致多糖溶液的不穩(wěn)定，降低了藥效活性物質(zhì)的含量，要想達到所需的藥效含量要求，就必須加大注射劑的用量等問題。同時需要指出的是，分級多糖注射劑的生產(chǎn)不必進行性質(zhì)測定所需的那些復(fù)雜操作，這也為五味子多糖分級注射劑提供了符合工業(yè)化生產(chǎn)要求的必備的支撐條件

［1］王 藝.中藥研究理論與方法［M］.北京:中國協(xié)和科學(xué)出版社，2008:90-100.

［2］陳文靜，季宇彬.五味子多糖藥理作用的研究進展［J］.食品與藥品，2007，9(12A):66-67.

［3］譚曉虹，王治寶，李如章.北五味子多糖的提取和含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(6):1463-1464.

［4］孟憲軍，秦 琴，高曉旭.五味子多糖的分離純化及清除自由基研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(1):91-94.

［5］張春玲，王 遂.低聚殼聚糖的制備及黏均分子量的測定［J］.食品科技，2007，3:200-202.