復(fù)方芪麝片中青藤堿及黃芪總苷的含量測定

周 昕， 謝瑞芳， 梁倩倩， 王擁軍

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科，上海200032;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所，上海200032)

復(fù)方芪麝片是由青風(fēng)藤、黃芪等中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有益氣化瘀、利濕通絡(luò)、消腫止痛的功能，臨床主要用于治療氣虛血瘀兼痰濕阻絡(luò)型頸椎病。其中青風(fēng)藤具有苦、辛、平，歸肝脾經(jīng)，具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，利小便作用，為本復(fù)方的主藥，含有青藤堿，具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，因此本試驗(yàn)以青藤堿及黃芪總苷為指標(biāo)成分對復(fù)方芪麝片進(jìn)行含量測定的研究。

1 材料

1.1 試劑

青藤堿(0774-200206)為中國藥品生物制品檢定所;復(fù)方芪麝片(031201，040910)為上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司;甲醇(Merck)，二乙胺，碳酸氫鈉、正丁醇(070817)等均為分析純，水為雙蒸水。

1.2 儀器

Agilent，TGL-16G臺式高速離心機(jī)，SB2200超聲儀，XW-80A型漩渦混合器。

2 青藤堿測定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相:甲醇-0.05%二乙胺水(39∶61)，流速:1 mL/min，檢測波長:262 nm，檢測溫度:25 ℃，進(jìn)樣量:5 μL。在此條件下，出峰時間為25.80 min，色譜峰與其它雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離(圖1，2)。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取青藤堿對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為0.32 mg/mL的對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

將復(fù)方芪麝片研碎，精密稱取0.5 g左右，置10 mL的量瓶中，加甲醇接近刻度，搖勻，超聲30 min，冷卻，加甲醇至刻度，靜置過夜。取上清液，10000 r/min離心10 min，用0.25 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將上述配制好的對照品溶液，稀釋至不同濃度(0.32～0.64 mg/mL)，進(jìn)樣。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=4.25×103X-0.403(r=0.999)。

圖1 青藤堿色譜圖

圖2 復(fù)方芪麝片色譜圖

2.5 精密度

吸取上述配制的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測峰面積。結(jié)果顯示RSD=1.4%，精密度良好。

2.6 重復(fù)性

圖3 復(fù)方芪麝片陰性樣品色譜圖

精密稱取研碎的復(fù)方芪麝片粉末6份，置10mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)樣品溶液的制備方法操作，測定。結(jié)果顯示RSD=3.5%，重現(xiàn)性良好。

2.7 回收率

精密稱取9份復(fù)方芪麝片粉末各約0.16 g，分3組，按照樣品含量的80%、100%、120%分別加入對照品溶液2，2.4，2.9(mL)，置 5 mL 量瓶中，加甲醇接近刻度，按照 2.3項(xiàng)樣品溶液的制備方法操作，得到的樣品溶液，進(jìn)樣，測峰面積。結(jié)果見表1，回收率良好。

2.8 樣品含量

分別精密稱取復(fù)方芪麝片粉末(031201，040910)各3份，至10 mL量瓶中，按上述樣品溶液的制備方法操作，得到的樣品溶液進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，兩批之間沒有顯著性差異。見表2。

表1 回收率考察

表2 復(fù)方芪麝片中青藤堿的含量測定結(jié)果(n=3)

3 黃芪總皂苷測定方法與結(jié)果

3.1 對照品溶液的配制

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為0.34 mg/mL的對照品溶液，備用。

3.2 樣品溶液的制備

稱取復(fù)方芪麝片樣品粉末0.7 g左右，置10 mL量瓶中，加水接近刻度，搖勻，超聲30 min，過濾，得到的濾液用正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并正丁醇液，用5%NaHCO3洗2次，每次30 mL，合并正丁醇液，在用純化水30 mL洗1次，得到的正丁醇液，水浴蒸干，用2 mL的甲醇溶解，10000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到續(xù)濾液，備用。

3.3 空白溶液的制備

取無水乙醇0.75 mL，置帶塞試管中，加8%香草醛無水乙醇溶液0.75 mL，冰浴中加入72%H2SO47.5 mL，62 ℃ 水浴20 min，冰水中冷卻至室溫。

3.4 吸收波長的確定

取上述配制好的對照品溶液適量，加無水乙醇至0.75 mL，按空白溶液制備方法操作，在190～900 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，最終確定吸收波長為533 nm(見圖4)。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取上述配制好的對照品溶液不同量，加無水乙醇至0.75 mL，按空白溶液制備方法操作，在533 nm處進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 0.32 ～0.64 mg/mL 的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=40.448X+0.0217(r=0.99997)。

3.6 穩(wěn)定性

取上述樣品溶液，按空白溶液制備，在 0、15、30、45、60、90、120、150 min時間點(diǎn)進(jìn)行測定，結(jié)果穩(wěn)定性良好。見表3。

圖4 黃芪總皂苷樣品和對照品圖譜

表3 復(fù)方芪麝片中黃芪總皂苷的穩(wěn)定性結(jié)果

3.7 樣品的含量測定

分別取上述制備的樣品溶液適量，加無水乙醇至0.75 mL，按空白溶液制備方法進(jìn)行操作，得到的溶液在波長為533 nm下進(jìn)行測定，結(jié)果見表4，兩批之間沒有顯著性差異。

4 討論

根據(jù)處方的功能主治，青風(fēng)藤、黃芪為方中主要藥味，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究要充分考慮主要藥味中有效成分的性質(zhì)，采用定性或定量的方法對這些成分進(jìn)行監(jiān)控，因此我們在本實(shí)驗(yàn)中對青風(fēng)藤中青藤堿、黃芪中的黃芪總苷含量進(jìn)行了測定。

表4 復(fù)方芪麝片中黃芪總皂苷的含量測定結(jié)果(n=3)

經(jīng)過參考文獻(xiàn)［1，2］多種流動相系統(tǒng)和比例的摸索，可知當(dāng)甲醇-0.05%二乙胺水比例為39∶61時，青藤堿能得到很好的分離。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于的復(fù)方芪麝片質(zhì)量控制的指標(biāo)成分之一。

為了測定復(fù)方中的黃芪甲苷，我們采用高效液相的方法，不能達(dá)到很好的分離［3］，所以試著按照文獻(xiàn)［4，5］采用紫外分光光度的方法測定黃芪總苷的含量，為了排除干擾，我們采用正丁醇萃取，并且用5%NaHCO3清洗，結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定可行，可以用于生產(chǎn)中快速測定。

［1］常新全，李瑞峰，康 靜.HPLC測定秦芪消痹顆粒中的青藤堿含量［J］.中成藥，2004，26(10):附23-24.

［2］閆克里，朱秀卿，趙 麗，等.高效液相色譜法測定豹骨活絡(luò)丸中藥材青風(fēng)藤中青藤堿的含量［J］.中國藥物與臨床，2007，7(6):462-463.

［3］中國藥典［S］.2005:212-213.

［4］龔純貴，李捷偉，趙 亮，等.比色法測定扶正消平膠囊黃芪總皂苷的含量［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2002，20(5):300-302.

［5］周從輝，熊義濤.康欣膠囊中黃芪總皂苷的含量測定［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24(1):52.