神經節苷脂對新生鼠缺血再灌注腦損傷神經細胞凋亡的影響

劉 華，付翠捧，孫曉梅，吳玲玲

目前，因圍產期窒息導致的新生兒缺氧缺血性腦損傷是新生兒病死的主要原因之一，新生兒缺血缺氧性腦損傷 （hypoxic ischemic brain damage，HIBD）是圍生期新生兒窒息引起的腦損傷,是常見病、多發病。嚴重者可威脅新生兒生命，生存者易留下神經系統后遺癥,如腦癱、智力障礙、癲癇、痙攣和共濟失調等。必須及早用藥干預治療。但目前治療效果尚不太滿意。故尋找治療HIBD更為有效的方法有重要意義。有研究顯示外源性單唾液酸四已糖神經節苷脂（GM1）可以透過血腦屏障，模擬內源性GM1減輕腦缺血再灌注損傷[1，2]。為探討GM1在腦缺氧缺血后神經元的保護作用及在神經細胞的凋亡過程中的作用，筆者在新生大鼠腦缺血再灌注模型基礎上，通過給予外源性GM1，分組比較，以病理學及相關血清學指標的測定為依據以探討GM1在HIBD中的作用與機制。

1 材料方法

1.1 實驗動物及分組 生后6 d Sprague-Dawley（SD）新生大鼠30只（購自東南大學實驗部），雌雄不限，體重10～25 g。隨機分為A組（假手術對照組）10只，B 組（腦缺血再灌注組）10只，C 組（GM1治療組）10只。其中，B組、C組缺血2 h再灌注46 h，C組于術前30 min和建模后即刻及24 h以后腹腔注射GM1，每次用量10 mg/kg，術后48 h取靜脈血后迅速處死各組動物。

1.2 動物模型的制備[3]采用改良的Longa動脈拴線法制備大腦中動脈缺血再灌注模型。B組和C組于術后2 h將尼龍線拔除。A組除不插尼龍線外步驟同上。

1.3 電鏡標本的制作 A、B、C組各取2只大鼠，迅速處死后，取出距額極5 mm處的梗塞灶邊緣區腦組織 1 mm×1 mm×1 mm，固定、脫水、包埋、切片、染色后，應用JEM-200電鏡觀察、照片。

1.4 測內皮素（ET） 用放射免疫方法（試劑盒購自301醫院東亞免疫技術研究所）。

1.5 血清NO水平測定 用鍍銅鎘還原法。測定外周血中NO2-/NO3-含量，721型分光光度計（上海第三儀器廠生產），波長545mm處測定各樣本的吸光度值，系列亞硝酸鹽溶液建立標準曲線。

1.6 細胞凋亡染色 采用TUNEL法（TUNEL試劑盒購自北京中山生物制品公司）。

1.7 圖像分析與統計學處理 用Leuzer-F型圖像分析儀，在400倍視野下，每張切片隨機選取4個區域，每個區域面積均為200 μm×200 μm，區域TUNEL染色陽性細胞數。實驗數據求出±s，均數間的顯著性分析采用t檢驗。

2 結 果

2.1 切片大體外觀 A組皮質、基底節等區域神經細胞無變性、壞死現象，神經元細胞形態結構正常，偶見凋亡神經元細胞。B組缺血側皮質、基底節等區域神經細胞變性、壞死灶多見，電鏡下部分細胞溶解、破碎，周邊大量神經細胞體積皺縮，表面迂曲，胞膜內陷，染色質聚集于核膜下呈小塊狀，可見大小不等的凋亡小體。C組缺血側皮質和基底節等區域的神經元，無變性、壞死改變，毛細血管內皮細胞腫脹，膠質細胞足突輕度水腫，電鏡下細胞核不規則，染色質輕度聚集，核仁清晰可見，線粒體除少許腫脹外，多數正常。

2.2 ET測定結果 B、C組血漿ET含量明顯高于A 組（P<0.01），而 C 組明顯低于 B 組（P<0.01），見表1。

2.3 血清NO水平 A組與B組比較差異非常顯著（t=4.094，P<0.01）；A組與C組比較無顯著性差異（t=0.657，P>0.05）；B組與C組比較有非常顯著性差異（t=3.239，P<0.01）。 見表 1。

表1 三組鼠血漿ET及血清NO測定結果（±s）

表1 三組鼠血漿ET及血清NO測定結果（±s）

與 A 組比較，△P<0.01；與 B 組比較，※P<0.01

A組 B組 C組ET（ng/L） 31.6±3.06 50.45±5.21△ 41.67±4.20△※NO（mol/L） 44.67±8.6 63.65±9.9△ 47.7±9.8※

2.4 TUNEL染色陽性細胞數 凋亡神經細胞核呈棕色，在A組中偶可見凋亡細胞，B組凋亡細胞主要位于梗塞邊緣區的內側，梗塞中心區域可見散在的凋亡細胞，C組凋亡細胞數量更少，其凋亡細胞的分布形式與B組相似，見表2。

3 討 論

3.1 GM1的腦保護作用 本文結果顯示缺血再灌注組梗塞區的病理變化明顯重于GM1治療組（P<0.01），GM1治療組鼠腦梗塞區多數神經膠質細胞未發現不可逆改變，超微結構相對完整，無明顯血管源性及細胞毒性水腫變化，表明外源性GM1的應用可在一定程度上減輕腦神經細胞的變性、壞死的病理過程。細胞凋亡是嚴格基因凋控的細胞程序性死亡，多種因素可誘導或抑制細胞凋亡的發生，筆者通過 TUNEL染色發現，局灶性腦缺血再灌注后有大量凋亡細胞出現，主要分布于梗塞邊緣區內側，即缺血半暗帶，這與LIY等的觀察結果一致。而位于缺血半暗帶的腦神經細胞功能尚處于可逆階段，此時若給予有效的功能恢復措施，細胞功能可復原如初。本文結果表明，使用GM1組細胞凋亡過程受到抑制，說明GM1有保護腦細胞作用。

表2 三組新生大鼠TUNEL染色陽性細胞數（±s）

表2 三組新生大鼠TUNEL染色陽性細胞數（±s）

與 A 組比較，※P<0.01；與 B 組比較，△P<0.01

計數區域 TUNEL染色體陽性細胞數A 組 75 3.4±1.2 B 組 150 115.5±17.2※C 組 150 84.2±11.1※△

3.2 內皮素的作用 經動物實驗和臨床證實，在腦缺血或急性腦梗死早期，測定血漿內皮素（endothelin，ET）即有明顯升高，ET是一種血管活性肽，其收縮血管作用強于血管緊張素Ⅱ、加壓素及神經肽Y，且持久。ET升高可引起缺血區側枝血管強烈、持久地收縮，使病灶局部血流進一步減少，加重梗塞區腦組織及神經細胞損傷，形成惡性循環，影響預后及轉歸。本文在腦缺血再灌注48 h測得ET明顯升高，但C組的ET升高明顯低于B組，說明ET升高持續于再灌注后，缺血區血流再通過后其區域的微小血管處于高度收縮狀態，對腦組織損傷作用可能在于再灌注損傷之中，本文結果證明GM1有明顯降低內皮素作用，防止缺血區血管及微小血管強烈痙攣所造成的腦組織持續損傷，因而有明顯的腦保護作用，但GM1降低內皮素的作用是直接的還是通過抗自由基而減輕腦組織血管內皮損傷實現的，有待于進一步研究。

3.3 GM1對血清NO的影響 本文結果顯示，缺血再灌注組NO2-/NO3-含量明顯高于假手術對照組（P<0.01），而GM1治療組其含量明顯低于缺血再灌注組（P<0.01）。NO是一種具有自由基性質的氣體生物活性分子，腦缺血缺氧后可出現血清NO暫時性或一過性升高[2，5]，而延遲性升高多發生在24 h達高峰，并維持數天。大量研究表明，NO在腦缺氧缺血性損傷中具有神經保護和神經毒性的雙重作用,生理狀態下，NOS催化L2Arg和分子氧生成低水平固有型NO，作為內皮源性舒張因子具有舒張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、拮抗氧自由基的作用；但HIBD后nNOS及iNOS被激活[6-8]，NO過度合成則可干擾與生物轉化有關的酶類的活性、破壞DNA結構、抑制線粒體的呼吸功能,具有明顯的神經毒性作用，與進一步導致腦水腫等腦損傷有關，造成神經元的損傷。其功能在腦缺血再灌注組NO2-/NO3-含量明顯高于假手術對照組也表明此機制。而且，GMI治療組與其他組比較可推斷GM1通過降低血清NO測定值起到保護腦神經細胞的作用[9]。

研究表明GM1通過抑制SD大鼠腦缺血再灌注后ET和NO的生成減輕神經元細胞的變性、壞死，抑制神經元細胞的凋亡，起到腦保護作用。

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[3]Ferrai G,Anderson BL,Stephens RM,et al Prevention of apoptoic neuronal death by GM1 ganglioside[J].Biol Chem,1995,270:3074.

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[8]Zhang GQ,Hao XM,Zhou PA,et al.Puerarin blocks transient out ward current and delayed rectifier current in mice hippocampal CA1 neurons[J].Acta Pharmacol Sin,2001,22(3):253-256.

[9]范海虹，汪華僑，劉存領，等.新生大鼠缺血缺氧性腦損傷后神經節苷脂的保護作用[J].實用兒科臨床雜志，2000，15（6）：311-313.