淋巴管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

劉衛(wèi)梅

（河南省焦作市第二人民醫(yī)院病理科，河南焦作 454100）

移行細(xì)胞癌是膀胱最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占90%，好發(fā)于50歲以上的男性，與外源性化學(xué)性致癌物質(zhì)（苯胺、聯(lián)苯胺、萘胺等）、內(nèi)源性色氨酸等代謝產(chǎn)物及吸煙等致癌因素有關(guān)，血尿是常見(jiàn)癥狀，可發(fā)生于膀胱的任何部位。血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的必需因素，最近研究結(jié)果提示，某些腫瘤除誘導(dǎo)新生血管形成外，還能誘導(dǎo)新生淋巴管形成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)新生淋巴管向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，淋巴管生成系統(tǒng)不僅是許多腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，更是判斷腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[1]。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種較特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于淋巴管形成的研究[2]。本文運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)膀胱移行細(xì)胞癌D2-40標(biāo)記的淋巴管密度（LVD）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)情況，探討LVD和VEGF表達(dá)的相關(guān)性及膀胱移行細(xì)胞癌臨床病理因素的關(guān)系和在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2006年1月～2009年10月手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)病理確診的膀胱移行細(xì)胞癌74例，患者年齡29～62歲，平均46歲。發(fā)生于肌層浸潤(rùn)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的54例，黏膜內(nèi)癌（惡性上皮局限于黏膜與肌層交界處）20例；其中，高分化24例，中分化23例，低分化27例。浸潤(rùn)深度：＜1/2肌層25例，≥1/2肌層29例。

1.2 方法

手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察。應(yīng)用免疫酶標(biāo)組織化學(xué)二步法分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記，DAB顯色，乙醇梯度脫水，封固。所用一抗為兔抗人VEGF單克隆抗體，鼠抗人D2-40單克隆抗體、二抗通用型PV-9000均為即用型，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 結(jié)果判定

VEGF陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。按照喬宏等[3]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：①選染色均勻的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域，以著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的多少分級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0級(jí)；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%為1級(jí)；26%～50%為2級(jí)；＞50%為3級(jí)。②按著色細(xì)胞染色強(qiáng)弱計(jì)分：無(wú)著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2 分；深棕色為 3 分。 ①+②的判斷結(jié)果：0～2 為（-）；3～6 為（+）。D2-40陽(yáng)性物質(zhì)定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜，淋巴管計(jì)數(shù)按照Straume等[4]和潘敏鴻等[2]的方法，先后在低倍鏡（×100）下掃描切片，選擇其中淋巴管高密度區(qū)，然后在高倍鏡（×400）下計(jì)數(shù)被D2-40抗體染成棕黃色的淋巴管數(shù)目，每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要能與鄰近脈管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開(kāi)，即視為1個(gè)淋巴管。結(jié)果以10個(gè)高倍視野下的淋巴管數(shù)目均值表示測(cè)定LVD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LVD和VEGF在不同膀胱組織中的表達(dá)

VEGF陽(yáng)性率和LVD在正常移行上皮、不典型增生移行上皮、移行細(xì)胞癌三組中表達(dá)逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；浸潤(rùn)深度≥1/2肌層組VEGF陽(yáng)性率和LVD高于浸潤(rùn)深度＜1/2肌層組和黏膜內(nèi)癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；8例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF陽(yáng)性率和LVD高于66例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

LVD和VEGF陽(yáng)性率在黏膜內(nèi)癌組與浸潤(rùn)深度＜1/2肌層組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LVD和VEGF在膀胱移行細(xì)胞不同分化程度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 VEGF和LVD的相關(guān)性

LVD在74例膀胱移行細(xì)胞癌VEGF陽(yáng)性組中高于VEGF陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

膀胱移行細(xì)胞癌的侵襲與轉(zhuǎn)移往往伴有適宜其生物學(xué)行為表達(dá)的多種因素的變化，其中腫瘤周?chē)h(huán)境的重建、血管及淋巴管的再生已成為研究的熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外已有不少有關(guān)VEGF和LVD在膀胱移行細(xì)胞癌中的報(bào)道。

表1 VEGF和LVD在不同移行上皮組織中的表達(dá)（）Tab.1 The expression of VEGF and LVD in different transitional cell cancers()

表1 VEGF和LVD在不同移行上皮組織中的表達(dá)（）Tab.1 The expression of VEGF and LVD in different transitional cell cancers()

病理改變 n VEGF[n(%)]LVD P值-+組織類(lèi)型正常移行上皮1413（92.86）1（7.14）2.90±0.96＜0.05移行上皮非典型增生159（60.00）6（40.00）5.29±1.31移行細(xì)胞癌7424（32.43）50（67.57）10.03±3.38癌分化程度高2410（41.67）14（58.33）10.15±3.45＞0.05中238（34.78）15（65.22）9.40±4.15低276（22.22）21（77.78）10.47±2.52肌層浸潤(rùn)無(wú)（黏膜內(nèi)癌）2010（50.00）10（50.00）8.33±2.01＜0.05＜1/2肌層2510（40.00）15（60.00）9.03±2.95≥1/2肌層294（13.79）25（86.21）11.18±2.81淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)6624（36.36）42（63.64）9.50±2.87＜0.05有80（0）8（100.00）15.42±3.12

表2 膀胱移行細(xì)胞癌中VEGF和LVD的關(guān)系（）Tab.2 The relationship between VEGF and LVD in bladder transitional cell cancers()

表2 膀胱移行細(xì)胞癌中VEGF和LVD的關(guān)系（）Tab.2 The relationship between VEGF and LVD in bladder transitional cell cancers()

VEGF n LVDP值-246.99±1.78＜0.05+5011.62±3.00

VEGF是由2條亞基間及其亞基內(nèi)二硫鍵連接而成的同源性二聚體糖蛋白化合物，是一種具有高度特異性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可以選擇性地增強(qiáng)血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)脈管生成，提高脈管特別是小脈管的通透性，增強(qiáng)其趨化性，促進(jìn)新生脈管的建立[5]。VEGF家族成員包括VEGF-A、-B、-C、-D和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PIGF）。VEGF-A始終被認(rèn)為只能通過(guò)VEGFR-1、VEGFR-2途徑作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成過(guò)程。然而最近的體外研究結(jié)果顯示，VEGF-A也可以促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，而且體外和體內(nèi)原位試驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在VEGFR-2的表達(dá)，VEGF-A促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用可以通過(guò)阻斷VEGFR-2被抑制[6-7]。Hirakawa等[8]在轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)VEGF-A不僅強(qiáng)烈促進(jìn)腫瘤血管生成，也促進(jìn)了表達(dá)VEGFR-2的腫瘤淋巴管活化與增殖及腫瘤向前哨淋巴結(jié)、遠(yuǎn)端淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的VEGF-C是VEGF家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，目前已在大多數(shù)人類(lèi)惡性腫瘤（如前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、惡性黑色素瘤、纖維肉瘤等）組織中檢測(cè)到，其表達(dá)均明顯高于正常組織，并與腫瘤淋巴管形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。Stacker等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-D不但可誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)的淋巴管形成，而且可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)擴(kuò)散。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常移行上皮、不典型移行上皮、移行細(xì)胞癌組織中VEGF陽(yáng)性率逐漸增高，并與浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示VEGF在移行細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，并可作為移行細(xì)胞癌惡性程度及預(yù)后判斷的指標(biāo)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF陽(yáng)性率與腫瘤細(xì)胞的分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。移行細(xì)胞癌中VEGF陽(yáng)性組的LVD明顯高于VEGF陰性組，也提示VEGF具有促進(jìn)淋巴管生成的作用。

腫瘤的生長(zhǎng)與腫瘤血管的形成密切相關(guān)，但在腫瘤生長(zhǎng)的早期，尤其是轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)早期，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提供主要靠彌散方式及微淋巴管、新生淋巴管通過(guò)擴(kuò)張形式提供，且隨著腫瘤生長(zhǎng)淋巴管數(shù)量也在增加；管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在有腫瘤細(xì)胞靠攏的地方會(huì)出現(xiàn)明顯的間隙或缺口，有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管腔[10]。由于高LVD使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴系統(tǒng)更加容易，因此多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)淋巴管的形成促進(jìn)了癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11-12]，但也有不一致之處。Straume等[13]對(duì)皮膚惡性黑色素瘤的研究顯示，癌內(nèi)及癌周LVD與其淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)；而B(niǎo)irner等[14]在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。然而多數(shù)研究認(rèn)為，腫瘤淋巴管生成能促進(jìn)癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11-12,15-16]，造成分歧的可能原因是：①不同腫瘤淋巴管生成的機(jī)制可能存在一定的差異；②研究樣本量較??；③使用的微淋巴管標(biāo)志物不同。近年來(lái)，一些淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如VEGFR-3、淋巴內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（lymphatic vessel endothelial HA receptor-1，LYVE-1）和 podoplanin 等相繼出現(xiàn)，使得腫瘤淋巴管形成的研究取得了較大的進(jìn)展，但隨后的研究證實(shí)，這些標(biāo)志物并不是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種比較特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，使淋巴管計(jì)數(shù)及測(cè)量成為可能。本研究應(yīng)用鼠抗人D2-40單克隆抗體檢測(cè)不同不典型移行上皮組織中的LVD發(fā)現(xiàn)，在正常移行上皮、不典型移行上皮、不典型移行上皮復(fù)雜性增生伴不典型增生、移行細(xì)胞癌組織中LVD逐漸增高，并且隨著肌層浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，提示淋巴管生成在移行細(xì)胞癌發(fā)展過(guò)程中起重要作用，與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，移行細(xì)胞癌的分化程度與LVD無(wú)關(guān)，LVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。移行細(xì)胞癌的分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否相關(guān)有待于進(jìn)一步研究。一般認(rèn)為腫瘤的分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，造成分歧的可能原因是：①移行細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素很多，除腫瘤細(xì)胞的分化程度之外，可能其他相關(guān)基因及因子在其中發(fā)揮了更重要的作用，是多種因素共同作用的結(jié)果；②研究的樣本量少。

淋巴管的生成受多基因調(diào)控、多因素影響，在諸多因素中，VEGF家族已被證實(shí)與淋巴管的生成有關(guān)，此外還有透明質(zhì)酸（HA）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、整合素 α9β1、NRP-2、Net、Prox-1 和 Ang-2 等，但它們之間的相互關(guān)系及作用機(jī)制尚不清楚。不同個(gè)體及不同組織來(lái)源的惡性腫瘤，其惡性生物學(xué)行為表達(dá)的方式和程度各不相同。本研究初步探討了子宮內(nèi)膜樣腺癌LVD與VEGF表達(dá)的相關(guān)性、兩者與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理因素的關(guān)系及在其發(fā)生、發(fā)展中的作用。對(duì)于相關(guān)因素的探討可對(duì)子宮內(nèi)膜樣腺癌惡性生物學(xué)行為的表達(dá)提供進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，為臨床治療及預(yù)后提供參考指標(biāo)。郭子妲等[1]在裸鼠中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用針對(duì)VEGF的人源VEGF單克隆抗體Bevacizumab（Avastin）能夠抑制腫瘤血管和淋巴管的生成，從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，更為有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。隨著腫瘤淋巴管生成機(jī)制研究的不斷深入，針對(duì)特定腫瘤的抗腫瘤新生淋巴管治療有望成為繼抗腫瘤新生血管治療之后的又一種腫瘤生物治療新模式，具有良好的研究和應(yīng)用前景。

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