蜂膠清除自由基能力與總黃酮含量和醇溶物含量的相關性

（福建農林大學蜂學學院，福州 350002）

蜂膠可作為天然的抗氧化劑[1]，由于從不同產地、不同膠源植物采集的蜂膠成分有差異，從而導致不同來源的蜂膠抗氧化清除自由基能力也有差異?？傸S酮含量、醇溶物含量是蜂膠質量標準中必測的重要理化指標，探討蜂膠抗氧化清除自由基能力與兩者之間的相關性，為是否可能在測定了蜂膠總黃酮含量或醇溶物含量的同時，還可以快速地判斷來源不同的蜂膠抗氧化清除自由基能力的強弱提供依據。

1 材料與方法

1.1 蜂膠

原始蜂膠樣品共16個，分別來自遼寧喀左縣紫金蜂業科技公司、遼寧丹東、北京蜂業公司、北京天寶康高新技術開發有限公司、青海民和縣、陜西寶雞、四川成都、河南長興蜂業有限公司、河南新鄉、山西榆次晉中總蜂場、山東蒙陰縣蒙山蜂人蜂業有限公司、湖北隨州鴻發蜂產品有限公司、湖北隨州、杭州浙江大學動物科學學院、上?？岛鄨@蜂業有限公司、福州福建農林大學蜂學學院意蜂場。

1.2 儀器

752紫外可見分光光度計、KQ－300VDE型雙頻數控超聲波清洗器、多聯過濾器、DZF－6050真空電熱恒溫干燥箱、BS224S電子天平、FW100高速萬能粉碎機、碘量瓶、容量瓶、漏斗、移液槍、試管、燒杯等實驗室常規玻璃器皿。

1.3 試劑和溶液

0.2 mol·L－1磷酸緩沖液（pH7.4）、0.75 mmol·L－1鄰二氮菲無水乙醇溶液（現用現配）、0.75 mmol·L－1硫酸亞鐵溶液（現用現配）、0.01%過氧化氫溶液（現用現配）、100 g·L-1硝酸鋁溶液、9.8 g·L-1醋酸鉀溶液、95%乙醇、無水乙醇（以上試劑均為AR級）。

Tris-HCl緩沖溶液：稱取三（羥甲基）氨基甲烷1.211 g，用水溶解定容至100 mL，得0.1 mol·mL-1Tris溶液；量取 36%－38%HCl 0.429 mL，用水稀釋定容至100 mL,得0.05 mol/L HCl溶液，稀釋5倍得10 mmol·L-1HCl溶液；50 mL 0.1 mol/L Tris 溶液和45 mL 0.05 mol/L HCl溶液混勻，用0.05 mol·L-1HCl溶液調至pH值為8.2。

鄰苯三酚溶液:稱取0.0378g鄰苯三酚，用10mmol·L-1HCl溶解，定容至 100mL, 得 3mmol·L-1鄰苯三酚溶液。

蘆丁標準溶液：精確稱取經120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品50 mg，無水乙醇溶解、移入50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，準確移取10 mL，置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻。

1.4 蜂膠乙醇提取液的制備

蜂膠樣品經冷凍，高速萬能粉碎機粉碎，過80目篩后，準確稱取2g左右與95%乙醇按1：10（W/V）混和于碘量瓶中，搖勻，置于超聲波發生器內超聲提取[2]（超聲頻率45KHz、時間30min），取出后抽濾，分別收集濾液、濾渣，濾液再用中速濾紙過濾，得到澄清濾液，用95%乙醇稀釋濾液、定容，即為蜂膠乙醇提取液（簡稱蜂膠醇提液）。

1.5 蜂膠醇提液對羥自由基（·OH-）清除率的測定

試驗步驟：參照同類方法[4]，取1mL0.75mmol·L-1鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入2mL 0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液 (pH=7.4)和0.2mL蒸餾水，充分混勻，加入 1mL 新配制的 0．75 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液，混勻后加入1mL新配制的0.01%的過氧化氫溶液，于37℃水浴加熱60min后，在536nm測吸光值，所測得的吸光值為損傷管的吸光值。未損傷管以1mL蒸餾水代替損傷管中過氧化氫溶液，操作方法同損傷管，可測得536nm未損傷管的吸光值。蜂膠醇提液0.05mL代替損傷管中的蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得536 nm樣品管的吸光值。

1.6 蜂膠醇提液對超氧陰離子自由基(·O2-)清除率的測定[5]

試驗步驟：（1）鄰苯三酚自氧化速率的測定：移取 4.5mL 50mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2）、4.2mL蒸餾水于25mL的試管中混勻后，37℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入0.5mL 37℃預熱過3 mmol·L-1鄰苯三酚，迅速搖勻后倒入比色皿，325 nm下每隔30s測定吸光值，計算線性范圍內每分鐘內吸光值的增加。以10mmol·L-1HCl溶液作空白管為對照，記錄結果。（2）加入蜂膠醇提液后鄰苯三酚自氧化速率的測定：按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先加入0.5mL蜂膠醇提液，蒸餾水相應減少。同樣以10mmol·L-1HCl溶液作空白管為對照，測定吸光值。

式中：△A1/△t為鄰苯三酚自氧化時反應速率；△A2/△t為加入蜂膠醇提液后鄰苯三酚自氧化時反應速率。

1.7 蜂膠醇提液總黃酮含量的測定[6]

試驗步驟：將蘆丁配制成標準溶液，測定其吸光值，繪制標準曲線。用蜂膠醇提液1mL替換蘆丁標準溶液，測定其吸光值。根據標準曲線的回歸方程，計算出蜂膠醇提液中總黃酮的含量。

1.8 蜂膠醇提液醇溶物含量的測定

合并上述1.4中的濾渣，置真空電熱恒溫干燥箱內干燥至恒重，準確稱量。

結果計算：蜂膠醇溶物含量（mg·mL-1）=（原膠重-濾渣重）÷定容后濾液mL數

1.9 數據的處理

用統計軟件SPSS 15.0進行數據的處理。

2 結果與分析

2.1 蜂膠醇提液對羥自由基(·OH-)的清除率

用上述1.5的方法測定蜂膠醇提液對·OH-清除率的結果：16個樣品中清除率最低的為4.274%，最高的為67.52%，顯示不同來源的蜂膠醇提液對羥自由基都有一定的清除能力，但清除能力存在明顯的差異。這種差異主要來自于來源不同的樣品中清除·OH－的具體成分及其濃度的差異，詳見表1。

表1 蜂膠醇提液對羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率及其總黃酮含量和醇溶物含量

2.2 蜂膠醇提液對超氧陰離子自由基(·O2-)的清除率

用上述1.6的方法測定蜂膠醇提液對·O2－清除率的結果，16個樣品中清除率最低的為4.10%，最高的為26.95%，顯示不同來源的蜂膠醇提液對·O2－都有一定的清除能力，但清除能力存在明顯的差異，與清除羥自由基的能力對比，這種差異較小，詳見表1。

2.3 蜂膠醇提液總黃酮含量的測定

用上述1.7的方法測定了蜂膠總黃酮的含量，結果顯示來自不同地區蜂膠中的總黃酮含量差異明顯，最低的為 0.190 mg·mL－1,最高的為 0.454 mg·mL－1，這主要與樣品中醇溶物的含量關系密切，因為黃酮類化合物易溶于乙醇，詳見表1。

2.4 蜂膠醇提液醇溶物含量的測定

用上述1.8的方法測定了蜂膠醇溶物的含量，結果顯示來自不同地區蜂膠中的醇溶物含量差異明顯，最低的為 34.71mg·mL－1，最高的為 174.79mg·mL－1，這主要與蜂膠中雜質含量少或多關系密切，而蜂膠的雜質含量往往取決于采膠的方式，并且還與不同地區膠源植物種類的不同有關，詳見表1。

2.5 蜂膠醇提液對羥自由基的清除率與其總黃酮含量、醇溶物含量相關性分析

數據經統計軟件SPSS 15.0分析顯示，蜂膠醇提液對羥自由基的清除率與其總黃酮含量之間存在著極顯著的正相關關系（r＝0.751，P＝0.001＜0.01），與其醇溶物含量之間也存在著極顯著的正相關關系（r＝0.650，P＝0.006＜0.01）；表明醇溶物中的黃酮類化合物是蜂膠醇提液清除羥自由基的主要功效成分。

2.6 蜂膠醇提液對超氧陰離子自由基的清除率與其總黃酮含量、醇溶物含量相關性分析

數據經統計軟件SPSS 15.0分析顯示，蜂膠醇提液對超氧陰離子自由基的清除率與其總黃酮含量之間幾乎不存在相關關系（r＝0.414，P＝0.11＞0.05）；與其醇溶物含量之間也不存在明顯相關關系（r＝0.119，P＝0.66＞0.05）；表明蜂膠醇提液對超氧陰離子自由基的清除能力不由其中的總黃酮含量或醇溶物含量的高低所決定，還有其他的功效成分。

3 討論

試驗結果顯示，蜂膠醇提液清除自由基能力與總黃酮含量、醇溶物含量的相關性表現不一致。如清除羥自由基能力與總黃酮的含量、醇溶物的含量存在著極顯著的正相關關系，而清除超氧陰離子自由基能力卻與總黃酮含量、醇溶物含量幾乎不存在相關關系，相當于在已知不同來源蜂膠醇提液的總黃酮含量或醇溶物的含量后，可以判斷它們清除羥自由基能力的強弱；但仍無法判斷它們清除超氧陰離子自由基的能力。

沈海濤(2002)研究蜂膠在清除氧自由基試驗中發現，氧自由基的清除能力與總黃酮、總酚無對應關系[7]。陳明之（2007）研究的結果，蜂膠95%乙醇提取液清除羥自由基的能力與總黃酮含量呈正相關[8]。

蜂膠的成分復雜，這很可能是其清除自由基能力與總黃酮含量、醇溶物含量相關性表現不一致的原因。有人在北溫帶地區的蜂膠中鑒定出305個化合物，其中黃酮類化合物71個，芳香酸與芳香酸酯59個，氨基酸25個，醛與酮類化合物17個，脂肪酸與脂肪酸酯50個，萜類化合物19個，甾體化合物6個，糖類化合物9個，烴類化合物25個，醇、酚類和其他化合物24個[9]。

本試驗結果顯示清除羥自由基是黃酮類化合物在起主導作用，清除氧自由基不是黃酮類化合物而是蜂膠中的其它成分在起主要的作用，具體是那些成分、何種物質，怎樣發揮作用的還有待進一步的研究。

[1]唐傳核,孟岳成.蜂膠的生理功能以及開發研究 [J].食品工業科技,1999，（2）：30－32.

[2]葉靜凌，劉富海，乞永艷等.超聲技術在蜂膠提取上的應用研究[J].蜜蜂雜志(月刊)，2008，（5）：7－9.

[3]金鳴,蔡亞欣,李金榮等.鄰二氮菲－Fe～（2＋） 氧化法檢測H_2O_2／Fe～（2＋）產生的羥自由基[J].生物化學與生物物理進展,1996,(6):553－555.

[4]徐穎，方金鳳，顧嵐.蜂膠黃酮清除自由基作用的研究[J].食品工業,2008,(1):23－25.

[5]玄紅專,桑青,麻建軍.鄰苯三酚自氧化法測定不同蜂產品抗氧化活性的研究[J].食品科技,2008,(4):137－139.

[6]GB/T20574－2006:蜂膠中總黃酮含量的測定方法分光光度比色法.

[7]華啟云，李英華，胡福良.蜂膠抗氧化作用的研究進展[J].養蜂科技 2OO4，（5）：4－5.

[8]陳明之.蜂膠抗氧化作用研究[J].食品研究與開發，2007，Vol.28（.11）：40－41.

[9]郭伽，周立東. 蜂膠的化學成分研究進展[J].中國養蜂，2000，Vol.51（2）：17－18.