遺傳資源創新是我國地方豬種保存和利用的重要途徑——記我國近交系小型豬培育、利用20年

馮書堂

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193）

近交系實驗動物基因高度純合，能象物理學研究中的精密儀器和化學反應中的分析純試劑那樣，為生物醫學及生命科學研究提供靈敏的、偏差極小的實驗結果。為滿足人類生命科學研究的需求，國際上已培育出近交系小鼠388個、近交系家兔34個。但因大型動物繁育生理等諸多方面與小型動物不同，至今國內外未見成功報道（中國農業科學院科技信息中心查新,2009）。利用我國小型豬遺傳資源創新培育近交系小型豬，近交系豬培育成功作為人類“替難者”，將會有力地推動生命科學尤其是人類醫學、異種器官移植應用研究的發展。因此，利用我國小型豬遺傳資源創新實現近交系豬培育目標，有著重要的現實和歷史意義。

1 開闊視野、奮力探索、實現小型豬遺傳資源的創新

我國改革開放初期，1983年研究者在西德學習時，有幸參觀西德哥廷根小型豬（GottengenMinieturePig）育種中心，了解到該品種是通過“三品系”雜交等措施、歷經十多年培育而成的遺傳資源創新--哥廷根小型豬，并已銷售到多個國家和地區，大量應用于人類多種疾病動物模型。于是產生了引種回國開發應用的念頭，但由于種種原因未能實現。在此期間，國內經歷了大規模的家畜品種資源調查，發現了我國地方小型豬品種資源十分豐富，據不完全統計有六、七種，例如：香豬、五指山豬、滇南小耳豬、合作豬、藏豬等[1]。五指山小型豬（WZSP）就是其中一例，但已瀕臨滅絕（見1987年7月原中國農業科學院畜牧研究所馮維奇研究員、原廣東省畜牧研究所王正研究員等十七人參加的考察報告）。從資料和定點觀測數據上分析，WZSP的小型化特征、遺傳穩定性要遠遠好于西德哥廷根小型豬，具有較好的應用前景。

WZSP素稱“老鼠豬”[2]，原產我國海南省中南部山區。上世紀60年代存欄10萬頭，70年代存欄600頭，80年代初僅發現純種10余頭。如此迅速瀕臨滅絕，主要原因是其體型小、肉質好、沒有養公豬習慣、近親繁殖、產量極低，引進大體型肉用品種雜交改良“換種”而造成的。為挽救這一瀕滅豬種，從1987年起就開始了原地保種、定點觀察，本項目培育的近交系，就是從原產地定點觀察后、僅存留的同窩的1公1母近交繁育而成的。當時對該品系的研究僅限于一般的繁殖、生長發育性能觀察，對其種質特性、有何開發應用價值一時還很難說清。將其培育成為理想的、近交系實驗動物，需開展大量的研究工作。

中國農業科學院畜牧研究所原在1987年就成立了以馮書堂助理研究員為首的小型豬課題組，初步制定了培育研究技術路線：①采用“仔母配”和“全同胞配”等近交、實驗化培育；②近交鑒定研究；③遺傳穩定性、矮小性以及與人類近似性研究；④品系、品種間鑒定方法等研究等。為培育近交系豬實現資源創新奠定了基礎。20年來，經歷了研究者冒雨產地山區尋找的困苦、白云山機場托運的磨難、屢配不孕的困惑、臥息豬圈等待產仔的艱辛、近交帶來“三高一低”不良影響的焦慮、因保種負債累累、慘淡經營、而限制自我發展的無奈，更主要的是部、院、所領導重視、成功自信的喜悅和責任。

2 近交系小型豬遺傳資源創新取得的成就

2.1 由2頭豬建立近交系群體，確立為國家第一批畜禽遺傳保種場（C1101001）

目前已組建WZSP近交繁育群、三個家系基礎母豬群230頭、公豬20頭、F20近交系數高達0.986；培育的近交系較之原始種豬群具有性情溫順、遺傳背景清楚、基因高度純合、體色為黑白花、體型和毛色一致等特點，較之國內外品種更具有體型小、遺傳穩定等優勢。培育的新品系與原始品種從宏觀體色、體型到微觀等位基因的多態性已有本質的不同。

2.2 建立近交系培育技術方法[2]，授權發明專利（ZL02149030.9）

圖1 F16公豬

圖2 F14種豬群

圖3 F16母豬

圖4 原引種豬

圖5 原始種豬群

圖6 原始種母豬

利用同窩的1公1母WZSP為系祖，采用“仔配母”、“全同胞交配”結合分子遺傳標記、誘導發情、提高營養水平、定期舍外運動等綜合措施，最大限度的提高近交速度，最大限度提高群體基因的純合度、淘汰有害基因。逐步克服“三高一低”不良影響（成活率低、木乃伊和弱仔率高、死亡率高、斷代率高）；培育出了具有世界領先水平的近交系豬種群，F20近交系數高達0.986，具有體型小、基因高度純合；通過500頭次數據分析表明近交對繁殖力影響很大，F8～F9仔豬成活率極低、分別為19.05%、22.22%,并伴有發情不排卵、屢配不孕、斷代等現象。為解決這一難題，采取PMSG+HCG“誘導發情”、提高飼料營養水平（即：由13%的蛋白水平提高到20%）、定期舍外運動（效仿原生態環境）等措施，逐步克服近交對其繁殖力“三高一低”的不良影響。但隨著近交代數的推進，其仔豬成活率逐漸提高，斷代、死胎、木乃伊比例逐漸降低，窩產仔數亦有增加的趨勢。如F14窩產仔數為5.75±1.00，仔豬成活率為66.67%，死胎、木乃伊率為6.06%；并獲得近交F20，仔豬成活率達到80.0%以上（普通環境下）。培育的近交系較之原始種豬群具有性情溫順、遺傳背景清楚、基因高度純合、體色為黑白花、體型和毛色一致等特點（見圖1-8），較之國內外品種更具有體型小、遺傳穩定等優勢；其近交系數高達0.986；依據微衛星探針對F15個體在S0036等三個位點等位基因的純合度不同將群體分為三個家系。其近交系培育方法已獲國家發明專利（ZL02149030.9）。

2.3 高寒地區引種擴繁，證明了我國近交系品種豬培育成功的可靠性

2002年10月26日，與延邊農科院簽定了“僅限于進行肉食開發”引種協議，向其提供1公4母，截至2008年12月20日，6年內已產仔1600余頭，每年提供開發烤乳豬500余頭，現存攔426頭，其中262頭基礎母豬群、后備母豬53頭、種公豬16頭，商品豬95頭（見延邊農科院2008年12月20日向我所提供的“繁育及開發情況”報告）。證明五指山豬近交系已跨越近交死亡節段，近交系品種在中國已培育成功。

2.4 近交多方驗證、揭示其遺傳穩定性分子基礎[3]

依據世代DNA指紋圖相似系數、微衛星分析、皮膚移植等方法進行近交多方驗證：①微衛星探針監測證實：近交F8、F8-F9、F9-F10、F10個體間DNA指紋圖相似系數分別為0.678、0.785、0.855和0.906。表明隨著近交代數的推進其DNA指紋圖相似系數越來越高；9對微衛星探針對其F14、F15、F16群體檢測表明：隨著近交世代的遞增，群體的遺傳變異性降低，其家系Ⅱ的平均雜合度及平均多態信息含量分別為0.2075和0.1588，其值小于0.25、基因已高度純合。

華西醫科大學研究發現WZSP近交系F8群體DNA指紋圖相似系數（0.86）等同西雙版納小型豬近交繁育的F12（0.86）；孟安明等報導原引的2頭豬個體間DNA指紋圖相似系數已高達0.698。這一研究結果更為準確的判斷WZSP近交代數的推進提供了科學依據。

②利用PNAS-4(MspI)等10個SNP位點對三個品系小型豬檢測，其中9個SNP位點中，WZSP近交系有6個純合，廣西巴馬小型豬（以下簡稱：GXMP）和貴州小型豬（以下簡稱：GZMP）各有2個純合。表明WZSP近交后基因已高度純合。

③揭示了近交系豬等位基因的變化規律類同近交系小鼠。研究了F13-F1874頭近交系豬個體在14個具有多態性微衛星位點等位基因的變化規律，共發現38個基因，平均每個位點2個，大大低于海南五是山豬核心群每個位點9.63-14.93個（王興龍,2005），其中3個等位基因較早純合，多數等位基因隨近交代數提高逐步純合，少數2-3個等位基因始終處于高度雜合狀態（0.59-0.68）,可能是該品種生命所必需的，我們稱之為“生命基因”。

④對廣西、貴州小型豬和WZSP近交系小型豬三品種的Y染色體、線粒體DNA特異標記研究結果表明，WZSP近交系個體間相似性最大。

⑤皮膚移植檢測試驗

皮膚移植試驗是檢測和判斷近交系實驗動物最有說服力的證據之一。同解放軍304醫院、北京醫科大學合作開展了WZSP近交系皮膚移植試驗，F14和F19個體間進行的皮膚交叉移植試驗未見急性排斥反應發生。表明WZSP的近交繁育已達到相當高的水平。

上述研究結果，從分子遺傳學深層證實了WZSP近交培育的可靠性、遺傳穩定性，為其近交繁育體系的建立提供了科學的理論依據，并揭示了其遺傳穩定性的分子遺傳機理。

2.5 建立了近交系小型豬與我國其它小型豬品系、品種間的鑒定方法和標準

通過蛋白質檢測、微衛星和線粒體DNA分析、SRY等基因的SNP分析等分子生物學手段，發現WZSP、貴州、廣西巴馬小型豬在11個微衛星位點上分別有22、49、25個等位基因可作三品系種間的鑒定；AKP蛋白質標記AA型和SW93688bp為WZSP近交系特有遺傳標記、并已授權國家專利(200510008994.2)，亦可作與其三品系種間的鑒定手段之一。

2.6 初步揭示近交系小型豬其矮小型分子遺傳機理[4]

我國WZSP近交系具有矮小型特征，通過GH、GHR等基因分析，發現其GH、GHR基因序列與普通豬不同、類似侏儒人，為其成為理想的醫學模型提供科學依據。如：研究發現WZSPGH基因(登錄號:DQ415717)兩個位點突變，引起編碼氨基酸的改變；GHR基因(登錄號:DQ422962)其胞內結構域五處突變，可能對GHR的胞內信號轉導產生一定的影響，從而影響GH-GHR-IGF-Ⅰ內分泌生長軸信號傳遞，削弱生長激素的促生長作用；同人的Laron綜合癥由GHR的缺陷導致GH信號轉導中斷取得一致性的結果。

2.7 初步揭示近交系小型豬與人類免疫同源性分子遺傳機理[5、6]

MHC基因決定人和動物種群和個體間是否發生免疫排斥反應。人的MHC稱HLA、豬則稱SLA，MHC基因群分為三大類,其中Ⅰ、Ⅱ與免疫密切相關，SLA與HLA越相近、越適合豬→人器官移植。通過對我國WZSP實驗用小型豬SLA分析發現，SLA-Ⅰ類基因有10個新的等位基因（登錄號:DQ399654等)，在3個關鍵氨基酸殘基上與人的完全相同；SLA-Ⅱ類基因中發現DRA、DRB、DQA、DQB等基因與人類亦有較高的同源性（75%～100%）等。研究還證實三個品系小型豬42種血液生理生化值、生理解剖、器官大小、代謝等近似人類，較之哥廷根小型豬和普同家豬更近似人類[3]；上述研究結果初步揭示我國實驗用小型豬與人類免疫同源性分子遺傳機理，并為研究解決異種器官移植排斥反應提供參考數據。

2.8 近交系小型豬內源性逆轉錄病毒（PERV）生物安全性研究

協作組章金鋼教授等在國內首次對小型豬進行內源性逆轉錄病毒（PERV）的群體檢測[7]，先后對8個品系群體檢測10次達3000余頭次。獲得了WZSP實驗用近交系PERV前病毒全長克隆、序列測定并登陸GenBank（序列號EF133960），首次證實WZSP近交系PERV-A型（74.43%）的表達率低于B型（95.40%），未檢測到PERV-C型的存在與表達，這降低了具有較強感染能力的A/C重組毒出現的可能性,為今后篩選A、B型低表達個體或品系，減少豬異種移植物的PERV基因序列負荷、降低豬異種移植排斥反應的發生，提供寶貴的材料和科學依據。該近交系小型豬無PERV-C、部分個體不含PERV-A型等，可能是長期近交使PERV-C基因片段和部分PERV-A基因片段丟失造成的。

2.9 開展了近交系小型豬SPF凈化研究[3、8]

利用剖腹取胎、無菌接產、胚胎移植三種凈化方法，對WZSP近交系等三品系進行了凈化研究獲得成功[9]。經農業部獸醫疹斷中心和北京市獸醫疹斷中心檢測證明：培育的WZSP近交系種群無豬瘟、口蹄疫、豬丹毒、豬肺疫、細小病毒病、偽狂犬病、傳染性胃腸炎等七種病毒病，無喘氣病、萎縮性鼻炎、痢疾、布氏桿菌病、傳染性胸膜肺炎等五種細菌病原以及皮蘚、螨蟲等三種病原，獲得凈化種豬群體。制定了小型豬SPF飼養管理實施方案，總結出“凈化技術操作程序”技術規范。不僅為我國實驗用小型豬SPF培育和應用提供技術支撐。而且可為今后我國種豬凈化提供更加經濟、便利的新措施。經檢測合格獲得實驗動物屏障環境和普通環境使用許可證。

此外，深入研究和和掌握生長發育規律、獲得生理生化等指標、并對WZSP進行了生理解剖學研究，為其奠定開發應用基礎，建立了與近交系豬相批配的比較規范的飼料配方和標準。為首次制訂了國家、地方實驗用小型豬遺傳、營養、微生物標準（草案）提供了科學依據。

3 國家重視、多方資助與合作

中國農業科學院畜牧研究所自1987年至今，歷經20余年的努力，在農業部、科技部、國家自然科學基金委、北京市科委等先后資助下，從我國體型小、瀕臨滅絕的珍稀品種五指山豬中，分離、培育出世界上首批近交系豬。累計投資1500萬元，先后列為“七五、八五、九五”農業部畜牧重點：五指山小型豬選育、育近交系五指山小型豬培育與開發利用，實驗用小型豬的選育（1987～1993年，3870087，業187-1-14），國家畜禽資源保種場項目（2000、2002、2004、2006、2007、2008），國家五指山豬保種場建設項目（2003-2004）；國家自然科學基金重點項目：五指山豬實驗用近交系的建立（39830190）、國家自然科學基金重點項目：適于用異種器官移植豬基礎性研究（39830190）；科技部社會公益性重點專項：我國小型豬實驗化培育與生物安全性研究(2001DIA40036)；科技部科技基礎性工作和社會公益研究專項：五指山豬近交系及油雞資源保存和利用研(2003DEB6J078)；科技部“863項目：用于異種器官移植五指山小型豬SLA及EG細胞建系研究（2003AA215103）；以及科技部“十五”攻關項目、中國實驗用小型豬資源開發與研究應用（2004BA717B）；北京市科委2007項目、“實驗用小型豬地方標準研究（D07080200720701）”等十余項。先后同貴陽中醫學院、廣西大學、中國農業大學、農業部獸醫診斷中心、上海交通大學、軍事醫學科學院等相關單位，開展了一系列的合作研究，包括：實驗培育、種質特性測定[9、10]、分子遺傳基礎研究、以及其生物安全性研究、凈化培育、我國實驗用小型豬質量控制標準草案的制定等研究。

10余年來已累計向社會50多個單位提供上千頭近交系小型豬，進行深層次、多方位的開發利用，已成功應用于動物疾病模型、燒傷皮膚敷料、新藥檢測、眼睫膜保存與異種移植、生物工程和食品安全評價等著多面，如：北京友誼醫院、解放軍309等單位的肝腎臟異種器官移植研究；北京口腔醫科大學、天壇醫院口腔研究所、武警總醫院等單位的口腔疾病上的模型研究；北京阜外醫院心血管病動物模型研究；北京同仁醫院等單位的胰腺細胞異種移植、眼角膜保存與異種移植研究取得重要進展，眼角膜異種移植給猴子可存活280天以上；中國醫科院新藥安全評價研究中心、國家醫藥檢測研究中心；解放軍301總醫院等的糖尿病動物模型；解放軍304醫院的皮膚燒傷動物模型研究；解放軍309醫院腎臟移植新藥動物模型檢測與鑒定；國家獸藥檢察總所、軍事醫學科學院的豬瘟、腸炎等疫苗制劑檢測與鑒定；北京大學、中科院生化細胞研究所等小型豬胚胎干細胞建系研究[11]；軍事醫學科學院將WZSP用于戰地救護一類止血新藥實驗成功后，已獲得生產批號,立即投入生產等均有力的促進醫學發展。并多次舉行不同的研討會、申報專利多項、獲獎多項，使近交系小型豬取得長足的進展（詳見附件1-3）

4 討論

4.1 我國小型豬遺傳資源的保種與利用途徑

中國地方小型豬種的開發利用途徑大致分為三大類，其中與我國普通地方種豬（大型豬）相同有兩大類。

其中之一，利用體型小這一遺傳資源特點，進行引種、封閉群培育、完成遺傳、繁殖、生長發育、生理生化等指標測定后，直接上市提供實驗動物。如原北京農大王連純教授等1986-1987年先后從貴州、廣西引種91頭，貴州中醫學院甘世祥教授引種香豬2公4母[12]，原廣西農學院王愛德等1987年教授引種巴馬香豬16頭（2頭公、14頭母）[13]，此外云南農大、原上海農學院、原揚州農學院等單位先后利用此方式開展了小型豬遺傳資源的保種與利用。此外，貴州利用香豬肉質好這一遺傳資源特點，直接開發香豬烤乳豬、烤全豬，此利用方式類同普通地方種豬開發特優產品直接上市一樣。如，華南小耳豬類的烤乳豬，金華火腿、萊蕪豬大排、玉山豬紅燒肉等。

圖8 近交系豬性情較原始品種溫順

其中之二，進行雜交改良、實現遺傳資源創新[14]。在此方面從宏觀講，利用地方種豬培育二元雜交（地方豬占50%）、三元雜交（地方豬占25%，）或新品種（品系）開發優質產品直接上市。由于其體型大、產肉量高，其開發和影響的力度遠遠大于、好于小型豬品種。但上海交通大學等也利用“巴馬香豬×杜洛克”雜交此種研發模式，其后代了不僅肉質好、而且產量高、其優質肉產品也直接上市。就我國地方種豬采用雜交改良、培育出的雜交配套系、或新品種而實現遺傳資源創新，以滿足社會的需求所培育的北京黑、哈白、魯來黑豬、蘇太豬、新丹系黑豬、中育豬配套系、冀合白豬配套系、滇撒豬配套系[1、14]等而論，其群體近交系數一直均維持在2.50%以下。這種開發利用方式從現代基因工程技術層面上講，就是通過品種間的雜交，使其等位基因雜合度增加、多態性提高、基因資源更加豐富。從而實現我國地方種豬遺傳資源創新，是實現我國地方種豬有效保存和利用的永恒主題，也是我們祖先歷經萬般磨難經“人工選擇+自然選擇”、使其地方種豬種質資源才有如此豐富的原因所在。聯系當前我國大規模的施實“轉基因豬培育重大專項”研究，就可使我們更清析的認識到實現“種豬遺傳資源的創新”理念。即，利用基因組輔助育種和轉基因育種結合常規育種，培育家畜新種質資源的指導思想，家畜新種質資源的競爭和創新也是推動人類社會發展的表現形式。

其中之三，由于種豬遺傳資源開發目的與用途不同，我國地方小型豬種的開發利用還存在另一種與我國普通家豬（大型豬）截然不同的途徑和方式，那就是通過“近交繁育”、淘汰群體部份有害的等位基因、降低等位基因的雜合度和多態性，使之多數基因座等位基因的純合，穩定表達單一性狀，即將群體近交系數提高達98%以上，向“雜交改良、實現遺傳資源創新、群體近交系數維持2.50%以下”的開發利用反方向研究目標發展。這樣培育出遺傳穩定的近交系小型豬，可做為研究、解決人類疑難疾病、研制新藥產品、乃之今后異種器官移植需求供體理想的“替難者”。因此，培育“近交系品種豬”是實現遺傳資源創新另一個途徑。國家畜禽遺傳資源委員會專家、南京農大王林云教授曾精辟、明確的指出[15]：“五指山小型豬近交系（WZSP近交系）是中國農科院畜牧所從1989年開始培育的將中國地方豬種用作實驗動物的一個很好例子。它是從1987年開始在海南原地保種、定點觀察后，最終存留的同窩的1公1母兩頭豬近交繁育而成的。----目前存欄250余頭。已成為與原有五指山豬性能不同的一個新遺傳資源。”

4.2 近交系小型豬急待開展的工作

1）我國應提倡遺傳資源創新、敢于創新、科學創新，盡快建立近交系小型豬標準。目前國內、外還沒有近交系小型豬、也就沒有近交系小型豬的監測標準。因為一種動物遺傳監測標準的制定需要很長的時間和眾多使用這種動物的科學家從各個方面共同制定，如大小白鼠使用了很多年后才于1980年8月在國際實驗動物科學委員會（ICLAS）會議、國際抗癌協會（UICC）等諸多團體的協助下，在東京正式成立了對近交鼠的遺傳監控機構，有美、英、法、德、波蘭、日本等各國研究這方面的專家學者共同制定國際監測標準。我國實驗用小型豬研究已開展了30余年，隨著近交系小型豬作為實驗動物的學者提供詳細的實驗數據，可逐步建立我國近交系小型豬標準，進而促進我國近交系小型豬培育和研發工作的健康發展。也是培育合格的實驗用豬滿足社會的依據和需要。

2）培育合格的近交系實驗用豬滿足社會的需要:由于實驗動物科學在醫學發展中占有特殊地位，是生命科學的基礎和重要支撐條件。在一定程度上，實驗動物的質量決定了研究課題的成敗，研究成果的可信性和科學性。隨著小型豬在人類比較醫學皮膚移殖、心血管疾病、消化代謝實驗的應用，以及國家一類新藥的研制、生產和監測量的增加，對實驗豬的需求量會越來越大，小型豬需求量將會穩步增長。培育合格的實驗用豬滿足社會需要是首要完成的任務。

3）建立多種技術平臺，滿足社會需要:豬細胞人源化改造可用于人類疑難疾病的治療。因此，開展實驗用小型豬多種體細胞干細胞以及組織的保存，對其全方位、深層次的開發利用有著重要的意義。如建立皮膚、胰腺、骨髓、卵巢間充質、睪丸間充質、血液等干細胞系及分化技術平臺。

4）挖掘我國實驗用小型豬特有的等位基因及特性研究:我國小型豬種質資源豐富、特異性明顯。因此，進行我國實驗用小型豬特有的等位基因及特性研究，具有重要的理論和實踐意義。研究內容包括：建立我國不同品系實驗用小型豬高通量新基因發掘技術平臺，發掘和克隆一批具有自主知識產權的重要新基因；建立的高效規模化轉基因和多基因聚合技術體系；培育一批小型豬新型轉基因生物新材料和新品種。將是我國實驗用小型豬近期和中長期培育、開發利用應堅持奮斗的目標。

（其他文獻可函索）

[1]《中國家畜家禽品種志》編委會.中國豬品種志[M].上海科學技術出版社，上海，1986.

[2]馮書堂，楮武軍，王雅春，王端云.中國五指山豬[M].中國農業科技出版社，北京，1999.

[3]馮書堂.五指山小型豬實研用近交系培育研究成果[J].中國農業科學，2007，40：379-385.

[4]李吉濤.中國農業科學院博士學位論文“五指山豬近交系矮小性分子遺傳基礎研究”，2007，6.